Contribution to International Economy

  • Біотехнологія виробництва інтерферону
Список основних скорочень
ІФН - інтерферон
ІФ - іммуноферон
ІР Л - інгерферонова реакція лейкоцитів
ІД - імунодефіцити
КК - культура клітин
ФЕК - фібробласти ембріона курей
ПЕС - бруньки ембріона курей
ПЭК - бруньки ембріона корів
ДКЧ - діплоідна культура людини
КЕ - курячий ембріон
БАВ - біологічно активні речовини
БАП - біологічно активні препарати
ВВС - вірус везикулярного стоматиту
ВБН - вірус хвороби Ньюкасла
ВБА - вірус хвороби Ауески

Вступ
Актуальність теми. Постановою координаційної наради Ювілейної Міжнародної конференції «Теоретичні й практичні аспекти виникнення й розвитку хвороб тварин і зашита їхнього здоров'я в сучасних умовах», присвяченої 30-річчю створення Всеросійського науково-дослідного ветеринарного інституту патології, фармакології й терапії були визначені основні напрямки досліджень хвороб молодняку сільськогосподарських тварин:
- розробка комплексної діагностики іммунодефіцитних станів молодняка всіх видів тваринних і ефективних лікувально-профілактичних і
препаратів для попередження патології органів
травлення й подиху й терапії хворих тварин;
- створення екологічно безпечної системи ветеринарного захисту молодняка від порушень обміну речовин і виникаючих на цій основі шлунково - кишкових респіраторних інфекційних хвороб із використанням високоефективних лікувально-профілактичних препаратів.
Аналіз причин захворюваності тварин в останні роки показує, що на тлі спорадичних випадків, невеликих спалахів або епізоотії окремих класичних інфекцій і появи нових маловивчених хвороб основний збиток тваринництву наносять факторні інфекції, що клінічно проявляються в маткового поголів'я порушеннями відтворної функції, а в молодняку ліврейним і респіраторними синдромами.
У зв'язку з вищевикладеним актуальним стає застосування препаратів, що володіють властивостями іммуномодуляторов, що проявляють противірусну антибактеріальну дія безпосередньо або опосередковано за рахунок стимуляції імунної системи, препаратів, що підвищують іммуногенність існуючих вакцин.
У цей час більш надійні зв'язують із препаратами інтерферонів, що є неспецифічними засобами захисту організму від вірусних інфекцій. Для інтерферонів характерними є противірусні, іммуностимуліруючі, антибактеріальні й антипроліферативні властивості.
Інтерферонізація може бути пасивною, коли організм насичується екзогенним, отриманим в іншій біологічній системі готовим препаратом інтерферону й активною, коли за допомогою різних стимуляторів (індукторів) організм сам виробляє власний ендогенний інтерферон.
Використання інтерферонів у комплексі лікувально-профілактичних заходів не слід протиставляти їхнім вакцинам, сироваткам і іншим біологічним і фармакологічним препаратам. У цей час актуальним є подальше поглиблене вивчання показань до застосування інтерферонів і індукторів його утворення, відпрацьовування схем і методів їхнього введення, у тому числі й у комплексі з іншими біологічно активними препаратами.
Концепція існування в організмі тварин висококомпетентной системи інтерферону, що сформувалася в процесі еволюції, і різноманіття виявлених і вивчених до теперішнього часу фізіологічних функцій інтерферону безсумнівно вказує на їхню контрольно-регуляторну роль у збереженні гомеостазу.
По значимості система ИФН наближається до системи імунітету, а по універсальності навіть перевершує її. Саме універсальність інтерферону, що робить його найважливішим фактором неспецифічної резистентності, послужила підставою для пропозиції інтегрального поняття « інтерфероновий статус».
Необхідність дослідження динаміки змін інтерферонового статусу (іфн-статусу) при випробуваннях нових препаратів інтерферону й іммуномодуляторів, розробці схем їхнього застосування диктується підходом, що передбачає правильне й раціональне використання системи інтерферону (ІФН) як терапевтичного засобу, що формує неспецифічну резистентність до вірусних захворювань у нормі й діючу при природному видужанні при патології.
Роль факторів (БАВ), що сприяють підвищенню поживності й засвоєнню корму, завжди була в центрі уваги вчених і тваринників. Продуктивність тварин залежить не тільки від наявності в достатній кількості жирів і вуглеводів, а й від кількості й співвідношення вітамінів, макро- і мікроелементів і інших біологічно активних речовин (БАВ). Однієї з головних причин виникнення факторних інфекцій є незабезпеченість високопродуктивних тварин повноцінними кормами й невідповідність якості кормів фізіологічним потребам тварин, що виражається феноменом антропогенних аномалій мікроелементного складу ґрунтів, води, кормів, мікробіоценозу ґрунтів, травного тракту тварин. Установлено також, що при використанні великого числа БАВ з різними властивостями може підсилюватися або послаблятися їхній активний початок, стимулюються або інгибіруються первісні властивості основних компонентів в процесі утворення продукції.
З огляду на вищевикладене, для профілактики масових хвороб тварин основні зусилля доцільно направити на стабілізацію й оптимізацію кормової бази тваринництва, за рахунок введення в раціон преміксів, що містять БАВ і препаратів, що підвищують резистентність організму й лікувально-профілактичні властивості.
Розробка схем комплексного застосування іммуностимуляторів (препаратів інтерферону) у комбінації з іншими БАЛ дозволить вирішити багато вищевказаних проблем ветеринарії й тваринництва.
З огляду на перспективність даної трупи препаратів, відповідно до вимог до лікарських засобів (наказ ДВ РФ № 31 від 23.10.95) нами проведені комплексні дослідження із з'ясування фармакологічних, токсикологічних і біологічних властивостей препаратів лигавирин, іммуноферон, біостим, промівит, фармавит з метою їхнього впровадження у ветеринарну практику.
Відповідно до поставленої мети вирішувалися наступні завдання:
- розробити технологію одержання інтерферону;
- вивчити токсичні властивості препаратів;
- вивчити інтерфероногенні, противірусні й іммуностимулюючі
властивості препаратів інтерферону;
- розробити показання х застосуванню препаратів;
- розробити схему комплексного застосування препаратів інтерферону.

Розділ 1. Характеристика інтерферону
Інтерферон - біологічно активні білки або глікопротеїни, продуцируючі клітиною на чужорідні агенти - віруси, бактерії, антигенне або митогенний вплив. Вивчено більше 20 інтерферонів, неоднорідних за структурою й біологічними властивостями, об'єднаних у три види (а, р, у), об'єднаних у два типи (I - а й р, II - у).
У цей час зложилося подання про систему інтерферону, що поєднує гени і їх репрессори, самі інтерферони, специфічні клітинні рецептори й, нарешті, ферментні системи, що активуються при взаємодії інтерферонів із цими рецепторами, насамперед Рнк-залежні 2',3 '-олігоаденілатсинтетаза (ОАС) і протеінкіназа (ПК).
Ф.І Єршов і О.И.Кисельов вважають, що сучасне подання про интерфероиах полягає в наступному: ЙНФ ставляться до цитокинам (медіаторів імунітету) і представлені сімейством білків, що володіють антивірусної,іммуностимулюючою, і противоопухлевою активністю, що дозволяє віднести їх біорегуляторам широкого спектра дії й гомеостатичними агентам.
Якщо стимулювати відповідні клітини яким - або індуктором, то відбувається активація генів, що кодують білки ІНФ, і трансляція-продукція цих білків. Інтерферон виділяється в позаклітинний простір і через рецептори діє на інші клітини. У результаті впливу ІНФ на рецептори стимулюється синтез протеїнів, які забезпечують резистентність клітини до інфекційного агента.
Можливий перенос таких протеїнів на сусідні клітини, не контактуючі ні з індуктором, ні із самим ІФН.
Методами генної інженерії встановлено, що інтерферони є модифікаторами імунної реакції. Це дозволило створити нову класифікацію підтипів інтерферонів. В оглядовій роботі В.В. Рафальского (1997) вказується, що сх/р інтерферони в цей час ставляться мінімум до 24 різних підтипів, які схожі між собою, однак не ідентичні по своїй первинній структурі.
На противагу цьому синтез в-інтерферону кодується всього одним відомим геном. Доведене структурне споріднення а-а- і Р-ІНФ відповідає функціональній схожості обох інтерферонів. Вони індуцируются вірусами й використовують ті самі клітинні рецептори, щоб реалізувати своя біологічна дія
Ідуктори й клітини-продуценти інтерферонів
Властивістю продуцировать інтерферон у різних кількостях володіють всі клітини організму. Активними продуцентами інтерферону служать іммунекомпетентні клітини (Шабалина Н.В. із соавт., 1995). Система інтерферону забезпечує захист кожної клітини й тому не має ні спеціалізованих клітин, ні спеціалізованих органів. Таким чином, кожна клітина повинна мати систему розпізнавання й елімінації чужорідної генетичної інформації.
Слід зазначити важлива обставина - виразність фізіологічного інтерферонового відповіді залежить від біохімічної структури вступників в організм тварини чужорідних агентів.
Утворення ІНФ різними клітинами імунної системи
Індуктор Основні клітини-продуценти Тип ІНФ
Віруси В, Т, М, NK* а
Poly-ICLC** М, NK, (T, В) а
Аллогенні чужорідні клітини В, NK а
Бактеріальні В-Митогени т а
Т-Митогени т У
Антигени (бактеріальні, вірусні й ін.) т
(сенсибілізовані) У
Пухлинні клітини NK У
Індукція а - ІНФ
Агентів, індуцируючих синтез а -ІНФ, дуже багато. До індукторів, що стимулюють утворення а-ІНФ лімфоцитами, відносять: пухлинні клітини; клітини; вірусні клітини; незаражені ксеногенні клітини.
Інтерферон синтезується у відповідь на індукцію як В-Клітинними митогенами, наприклад липолисахаридом, декстрансульфатом, так і Т-Клітинними, зокрема ФГА. Високоактивними індукторами а-ІНФ є мікроорганізми, зокрема бактерії. Класичними індукторами а -ІНФ служать віруси. Інтерферон здатні синтезувати практично всі іммуноцити. Основними продуцентами інтерферону уважаються макрофаги й В-Лімфоцити. Синтез ІНФ здійснюється в присутності Т-Клітин фенотипу Lyt l+2+. У відповідь на вплив туморогенних і вірусиндуцированних клітин а-ІНФ синтезують NK-клітини. Здатністю до синтезу а-ІНФ володіють эозинофили, гладкі клітини (И.С. Фрейндлих, 1995).
Клітини різних органів володіють властивостям індуцировать інтерферон, а саме - кісткового мозку й лімфи, мигдалин, селезінки. Клітини людини здатні синтезувати а-ІНФ у такому ж ступені, що й лейкоцити периферичної крові. Динаміка утворення інтерферону клітинами лімфи й лейкоцитами крові подібна. Макрофаги, виділені із клітин кісткового мозку людини, синтезують а-ІНФ у відповідь на зараження вірусами або обробку низькомолекулярними з'єднаннями (И.С. Фрейндлих, 1995).
Індукторами р-ІНФ служать всі речовини, що ставляться до класу двуспиральних ДНК як природного (виділені з вірусів, бактерій і дріжджів), так і синтетичного походження (полирибонуклеотиди). ( 5-ІНФ здатні індуцировать рослинні поліфеноли.

Основними продуцентами Р-ІНФ є клітини фібробластного й эпителиоидного типу, які відповідають синтезом ІНФ у відповідь на всі індуктори ( 3-ІНФ. Крім вищезгаданих, у продукції ІНФ-Р можуть брати участь і клітини імунної системи. Лейкоцити периферичної крові, у відповідь на митогенную стимуляцію, також здатні синтезувати Р-ІНФ. Здатністю синтезувати р-ІНФ володіють В- і Т-Лимфобластоидні лінії клітин у відповідь на вірусну стимуляцію.
Одним з істотних розходжень між ІНФ 1-го типу й ІНФ типу II ( в-ІНФ) є те, що індуктори типу I діють на багато видів клітин, а індуктори тину II тільки на іммунокомпетентні.
Основними продуцентами в-ІНФ є Т-лимфоцити CD4+, тобто Т-Хелпери 1-го типи (ТИ) . Процес синтезу залежить від присутності допоміжних клітин, в основному моноцитів і макрофагів. Останні не виробляють в-ІНФ безпосередньо самі, але в їхній присутності синтез цього лимфокина різко підсилюється. Також, крім Т-Лімфоцитів, можливими продуцентами в-ІНФ можуть бути В-Лімфоцити в присутності допоміжних клітин. Показано роль дендритних клітин у якості допоміжних при синтезі в-ІНФ тонзиллоцитами.
Цілком ймовірно, залежність синтезу в-ІНФ від присутності в культурах допоміжних клітин пояснюється здатністю останніх секретирувать МУЛ-1, що, як відомо, бере безпосередню участь у регуляції синтезу в-ІНФ.
Противірусна дія
ІНФ викликають стан несприйнятливості до великої кількості вірусів, що забезпечується у всіх клітинах, що має рецептори до ІНФ, Прийнято вважати, що ІНФ становить першу"лінію оборони" проти вірусу, що діє ще до того, як імунні механізми будуть повністю включені.
ІНФ не мають специфічність відносно вірусів і діють угнітаючі на репродукцію різних вірусів, хоча різні віруси мають неоднакову чутливість до ІНФ.
Противірусна дія ІНФ здійснюється через придушення проникнення вірусної частки в клітину, інгибицию синтезу мрнк і трансляції вірусних білків, а також через блокування процесів складання вірусної частки і її виходу з інфікованої клітини (мал. 1). Уважається, що придушення синтезу вірусних білків - основний механізм противірусної дії ІНФ.
У результаті зв'язування молекул ІНФ зі специфічними інтерфероновими рецепторами на поверхні клітин відбувається активація групи генів, локалізованих у людини в 21-й хромосомі. Цей процес супроводжується формуванням більше 20 нових внутрішньоклітинних білків, що сприяють виникненню резистентності до вірусів і які відсутні в клітинах, не подвергшихся впливу ІНФ. Основні із цих білків -ферменти, ОАС і протеинкиназа (ПК). Як ОАС, так і ПК можуть інгибировать синтез вірусних білків при наявності дсрнк. ОАС сприяє нагромадженню в клітині олигомеров адениловой кислоти, що активують латентну клітинну эндорибонуклеазу, що розщеплює як клітинну, так і вірусну РНК. ІНФ також активує фосфодиэстеразу, що розщеплює частину трнк і, таким чином, попереджає подовження пептидних ланцюгів. Деякі віруси здатні протистояти дії ІНФ, блокуючи синтез або придушуючи активність індукованих ІНФ білків Під впливом ІНФ у клітині синтезується два ферменти, один із яких гальмує синтез вірусних білків, іншої розщеплює утворені вірусні РНК. У результаті цього нові вірусні частки або не формуються, або їхня кількість зменшується на кілька порядків.


Рис. 1. Механізми прямої противірусної дії інтерферону
Малюнок ілюструє стадії вірусної реплікації, які інгибируются противірусними білками, індукованими інтерфероном. Більшість їх їх гнітять трансляцію вірусних білків (механізм 2), однак підпадають під вплив і інші етапи вірусної реплікації (механізми 1,3,4).
Між імунною й інтерфероновой системами існують тісні прямі й зворотні зв'язки. Однак в останні роки визначені також основні відмінності в спрямованості дії цих систем. Якщо головною функцією імунної системи є контроль за білковою сталістю багатоклітинних популяцій організму, то системі ІНФ належить провідна роль у нагляді за генетичним (нуклеотидним) сталістю (Ф.И. Єршов, 1996; Н.М. Грачова із соавт., 1996).
На імунну систему ІНФ можуть впливати різними шляхами, змінюючи:
експресію мембранних рецепторів і антигенів системи ГКГ;
продукцію й секрецію внутрішньоклітинних білків;
функціональну активність іммунокомпетентних клітин;
кількісний і якісний склад секретируемих цитокинов.
По визначенню Ф.И. Єршова секреція інтерферону у відповідь на вірусну інфекцію може бути визначена, як «ранні цитокинові реакції» (Р1ДР). Ці реакції лежать в основі природного імунітету.Таблиця 4
Иммупомодулирующие ефекти інтерферонів
Ефект ІНФ п-ІНФ Р-ІНФ Т-ІНФ
Активація макрофагів t
Проліферація Thi t
Проліферація Th? +
Дозрівання СВ4+лімфоцитів t
Проліферація СВ4+лімфоцитів T
Дозрівання СВ8+лімфоцитів t
Цитотоксичность CD 8+лімфоцитів t t
Активація В-Лімфоцитів т +
Проліферація В-Лімфоцитів +
Продукцияlg
Цитолитическая активність NK-Клітин t t i,
Експресія МНС I класу t t t
Експресія МНС П класу f
Цитостатический ефект t t t
РЦР являє собою швидко, що розвивається реакцію, захисних систем організму на віруси. Утворення ИНФ можна спостерігати інвитро відразу ж після інфікування культури клітин деякими вірусами.
При цьому спостерігається природний і найпоширеніший тип РЦР на віруси, які самі включають систему ІНФ, відіграючи роль природних індукторів.
Після впровадження вірусів у клітину виникає каскад реакцій, обумовлений індукцією утворення ІНФ і наступним руйнуванням вірусних геномних РНК і мрнк, пов'язаних з дією 2'-5'-олигоаденилсинтетази, що приводить до активації эндонуклеази ( RNA-Аза L), Паралельно активована протеинкиназа фосфорилирує а-субъединицу фактора ініціації трансляції eIF-2, після чого блокується синтез вірусних білків. У результаті відбувається придушення репродукції більшості ДНК- і Рнк-Утримуючих вірусів як наслідок прямого внутрішньоклітинного антивірусного ефекту. Цей сценарій реалізується протягом перших годин після проникнення вірусів в організм.
У першу чергу й/ р-ІНФ (так звані, ІНФ 1-го типу) активують природні киллери (ЕК) і цитотоксичні Т-Лімфоцити (ЦТЛ). При цьому на першому етапі вірусного інфікування локально (у воротах інфекції) відбуваються 3 взаємозалежні події:
внутрішньоклітинна інгибиція ІНФ репродукції вірусів;
видалення за допомогою ЕК і ЦТЛ інфікованого матеріалу;
захист знову утвореним ІНФ навколишніх незаражених клітин від можливого зараження. Цей механізм первинного захисту організму від вірусної інфекції спрацьовує багаторазово протягом життя (макроорганізму).
У найпростіших випадках, коли хвороба взагалі не розвивається, РЦР обмежується цим першим етапом. Накопичені дані свідчать про універсально широкий антивірусний спектр взаємодії вірусів і інтерферонів і малої значимості при цьому специфічності самих вірусів. У цілому перший етап РЦР реалізується місцево на рівні інфікованих клітин, у результаті чого запобігає подальша генералізація інфекції.
Однак у багатьох випадках захисна роль інтерферону не реалізується й результат не буває настільки швидким і сприятливим. Описані ефекти ІНФ виявляються недостатніми для переривання інфекційного процесу. Дефектність захисту проявляється, коли має місце масивне зараження, знижується опірність організму, що може виражатися в дефектності систем ІНФ і імунітету, несприятливій екологічній обстановці, дії стресів та ін. У цих випадках ми спостерігаємо гостре або хронічне інфекційне захворювання, що супроводжується послідовним утворенням ранніх цитокинов (другий етап РЦР), активацією СВ4+ і СВ8+ Т-Клітин з наступним розвитком специфічного Т-Т- і В -клітинного опосередкованого імунітету (H.L. Ploegh, 1998; М.Ю. Вершинина, 2002; С.A. Biron, 2001; С. Biron, 1998). При цьому крім ІНФ 1-го типу, синтезуються такі ранні цитокини, як фактор некрозу пухлин (ФНО) і в-ІНФ. Крім того, відзначається утворення МУЛ-1, -6, -10, -15 і -18, а також, що трансформує фактора, росту (ТФР). Відзначається відома варіабельність РЦР при різних вірусних інфекціях. При багатьох вірусних інфекціях відбувається продукція а/ р-ІНФ, що можна розглядати як ключову домінантну ознаку вірусного інфікування.
Варто підкреслити, що а/ р-ІНФ індуцирують серію інших неспецифічних реакцій, а саме викликають лейкопенію, набряки, лимфаденопатії, а також міграцію ядросодержащі клітин із червоної пульпи в білу пульпу селезінки. Таким чином, відбувається перерозподіл клітин для прояву наступних іммунорегуляторних ефектів. Нарешті, а/ р-ІНФ можуть підсилити специфічна імунна відповідь у період первинної інфекції шляхом залучення популяції В-В- і Т-клеток в області запалення для антигенної презентації (В.И. Покровський із соавт., 2003; С.A. Biron, 2001). РЦР може мінятися залежно від типу вірусу, що проникнув в організм, будучи відповіддю на конкретну вірусну інфекцію.
Таблиця 2
Ранні цитокини, що формуються у відповідь на інфекцію вірусів
Віруси Цитокиновий відповідь
Лимфоцитарпого ориоиенингита а/ р-ІНФ
Простого герпеса I типу а/р -ІНФ, в-ІНФ, МУЛ-la, МУЛ- 12, ФИО
Грипу а/ р-ІНФ, в -ІНФ, МУЛ- 12, МУЛ-18, ФИО
Всі вищезгадані цитокини продуцируются такими іммунонекомпетентними клітинами, як моноцити/макрофаги, ЕК, полиморфноядерні лейкоцити, а також клітинами різних органів і тканин, що не мають прямого відношення до імунітету. Очевидно, існує безліч різних варіантів РЦР як неспецифічних реакцій на прогресування інфекційного процесу, які в цілому являють собою важливий механізм неспецифічної імунної відповіді
До цитокинів із прямою антивірусною дією ставляться а/ р-ІНФ і ФНО, продуцируємі Ек-Клітинами. Зокрема, ФНО підсилює залежну від МУЛ-12 продукцію в-ІНФ (N. Boyer and P. Marcellin, 2000; S. Ludwing et al., 2002).
У цілому эффекторні механізми другого етапу РЦР можна представити в такий спосіб:
-продукція а/ р-ІНФ;
-активація ЕК- і Цтл-Клітин;
-продукція у-ІНФ;
-перерозподіл лімфоцитів;
-експресія генів МУЛ-1, ФНО;
-каскадна активація продукції інших цитокинов.
Все це разом узяте становить важливий механізм активації вродженого природного імунітету у відповідь на вірусне зараження й принципово відрізняється від реакції організму на дію інших патогенов невірусної природи. ФНО й в-ІНФ, продуцируемий ЕК, активують макрофаги, які залучаються у вогнище вірусної інфекції й беруть участь у противірусному захисті (Покровський В.И. із соавт., 2003). Ще однією відмітною ознакою РЦР на вірусну інфекцію варто вважати регуляцію генів, відповідальних за продукцію МУЛ-12, прямо пов'язаного із синтезом в-ІНФ (Л.С. Садиков із соавт., 1988; М.Ю. Вершинина, 2002; С.A. Biron, 2001; Сьогодні лікування злоякісних пухлин ґрунтується на трьох основних підходах: хірургічному втручанні, поліхіміотерапії (ПХТ) чи терапії цитостатиками, променевій терапії.
Незважаючи на певні успіхи такої комплексної терапії, ефективність останньої все ще лишається недостатньою: хірургічне втручання стає неможливим через застосування цитостатиків, а опромінення спричинює серйозний токсичний вплив на організм хворого, викликаючи при цьому тяжке ураження кісткового мозку, блокуючи кровотворення тощо. Усе це спонукає вчених шукати альтернативні шляхи лікування злоякісних захворювань, здатні послабити токсичний вплив цитостатиків і підвищити ефективність протипухлинної терапії.
Тому увагу дослідників передусім зосереджено на імунній системі, яка захищає організм від різноманітних інфекцій. Проте в боротьбі зі злоякісними клітинами ступінь захисту від них настільки низький, що імунна система не сприймає антигенність пухлини, як це має місце, скажімо, у разі пересадження органів і тканин, потрапляння в організм чужорідних бактерій тощо. Вчені чимало попрацювали над тим, щоб підвищити антигенність пухлини, "навчити" імунну систему не лише розпізнавати ракову клітину, а й знаходити можливість знешкоджувати її. Поки йде пошук такого універсального препарату, увагу дослідників привернув один із цитокінів - інтерферон. Якщо запитати клініцистів, що це таке, відповідь буде майже однозначною - імуностимулятор (а подумки додадуть - черговий). Тут вони в чомусь матимуть рацію, а в чомусь - ні.
Інтерферон дійсно є потужним імуномодулятором, проте для онколога ця властивість не найголовніша. Імуномодуляторів нині велика кількість, більшість з них вже апробовані в онкологічних клініках і дали обнадійливий ефект. Звідси - скептичне ставлення клініцистів, яким не відомі інші властивості цього поліпотентного цитокіну. Чим же цікавий інтерферон?
Відкритий цей білок був 1957 року як противірусний. Автори відкриття (Іsaacs та Linderman) помітили, що під час послідовного зараження клітин деякими вірусами перший з них "спрацьовує", клітини гинуть. Якщо ж першим вірусом (у незначній дозі) ці клітини попередньо обробити, а потім внести у повноцінній дозі наступний вірус - він не "спрацьовує", заражені клітини залишаються живими. Феномен, спостережений авторами відкриття, вони назвали інтерференцією вірусів, а відповідальний за цей ефект білок - інтерфероном.
Минуло чимало часу. Інтерферон виділили в чистому вигляді, почали вивчати (що він ще "вміє" робити?). Зокрема, ще в 1971 році я вперше описала антиканцерогенну дію інтерферону - цей цитокін запобігав виникненню пухлин, спричинених хімічними речовинами (канцерогенами), у мишей. Цей феномен через півроку потому був описаний американськими дослідниками із лабораторії Huebnera, після чого за інтерфероном остаточно закріпилася назва - антиканцерогенний цитокін.
Сьогодні встановлено, що інтерферон має противірусну, імуномодулювальну, антипроліферативну дію, здійснює прямий лізис пухлин клітин, інгібування ангіогенезу в пухлинній тканині і у вогнищі пухлинного росту; доведено гальмівну дію інтерферону на рухливість пухлинних клітин, його участь у стимуляції диференціювання останніх; встановлено детоксикувальний ефект (зокрема, за рахунок впливу на систему багатоцільових оксидаз печінки р-450); виявлено антимутагенну дію цього цитокіну, а також доведено його властивість посилювати апоптоз у пухлинних клітинах, які підпали під вплив ушкоджувальних чинників (у тому числі опромінення, цитостатиків тощо).
Сьогодні інтерферон уже застосовується в онкологічній клініці для лікування меланом шкіри та очей, раку нирок і сечового міхура, раку яєчників і молочної залози, багатьох лімфопроліферативних процесів (хронічний мієлолейкоз, волосяноклітинний лейкоз). Високу ефективність інтерферон продемонстрував під час лікування дисплазії шийки матки папіломавірусного генезу, що зробило цей цитокін доволі популярним засобом серед онкологів, які займаються названою патологією.
Широке клінічне застосування інтерферону стало можливим після успішного створення генно-інженерних чи рекомбінантних препаратів інтерферону, основаних на "вмонтуванні" гена інтерферону у різноманітні мікроорганізми, після чого останні набувають властивості продукувати інтерферон під час росту в різних живильних середовищах.
В Україні найчастіше застосовують вітчизняний інтерферон - лаферон, технологія отримання якого розроблена Інститутом молекулярної біології і генетики НАНУ, а доклінічні й клінічні дослідження проводили науковці Інституту експериментальної патології, онкології і радіології ім. Р.Є. Кавецького НАНУ. Лаферон, випуск якого нині налагодило Київське підприємство "Біофарма", - високоочищений рекомбінантний a2в-інтерферон, який впевнено пробиває собі дорогу в онкологічні клініки. Хоча не демонструє приголомшливих ефектів, проте достовірно знижує частоту виникнення метастазів на 10-20 відсотків й істотно подовжує тривалість життя онкологічних хворих.
Що стосується вірусних інфекцій, то тут отримано куди солідніші результати: використання лаферону виявилося досить ефективним під час лікування урогенітальних вірусних інфекцій, зокрема, кондилом і дисплазій шийки матки папіломавірусного і герпетичного генезу, оперізувального герпесу і герпетичних гангліонітів, вірусного гепатиту, папілом гортані, вірусних захворювань очей, енцефаліту (післягрипозного, післякорового). Не підлягає сумніву, що подальша розробка доз, схем і методів застосування лаферону розширить сфери його застосування - зробить істотний внесок у лікування вірусних і онкологічних захворювань.

Розділ 2 Технологія виробництва інтерферону
2.1 Біотехнічні процеси
Ампули інтерферону - зараз така ж приналежність будь-якої сімейної аптечки, як, наприклад, активоване вугілля або анальгін. І ми твердо упевнені, що це надійний друг, який захистить від усюдисущих вірусів, до того ж він абсолютно нешкідливий, і лікарки дають йому лише хвалебні рецензії. Імунологія відносить інтерферон до неспецІФічних чинників захисту. Треба віддати належне імунологам: вони вельми стримано відносяться до інтерферону в своїх публікаціях. Це особливо впадає в очі на тлі нестримного вихваляння інтерферону в сучасній медицині
Інтерферон - не далеко найсильніша частка імунної системи.
Відкриття інтерферону було визнане найбільшою подією в медицині і біології нинішнього століття. Саме так сприйняли це відкриття багато авторів спеціальної і популярної літератури: адже знайдена була особлива білкова речовина, здатна до певної міри захистити організм від будь-яких вірусів.
В 1957 р. вірусологи - співробітники Лондонського національного інституту англієць Айзекс і швейцарець Ліндеман випадково під час дослідів відкрили інтерферон. Дослідники зіткнулися з незрозумілим явищем: миші, яких заражали певними вірусами, не захворювали. Пошуки причин цього явища показали, що миші, що не піддалися зараженню вірусами, у момент зараження вже хворіли на іншу вірусну інфекцію. Виявилось, що в організмі мишей один з вірусів перешкоджає розмноженню іншого. Це явище антагонізму вірусів назвали англійським словом "інтерференція", що означає "перешкода", "перешкода". Воно наголошується при введенні в організм двох вірусів одночасно або з інтервалом не більше 24 годин.
Дослідники передбачили, що в цій боротьбі вірусів бере участь білок. Відповідний низькомолекулярний білок був виявлений і названий інтерфероном.
Інтерферон знайдений у всіх хребетних тварин, причому в різних видів тварин інтерферон різний; він максимально активний лише в клітках того виду тварин, від яких отриманий.
Інтерферон - один з неспецифічних чинників імунітету, чинників захисту постійності внутрішньої середи організму, імунологічного захисту гомеостазу.
Інтерферон - продукт самого організму
Було встановлене, що інтерферон виробляється будь-якими клітками організму як захисний засіб в перший же годинник впровадження в клітку яких-небудь генетично чужих агентів (антигенів), чужорідних білків і нуклеїнових кислот. Особливо інтенсивно клітки синтезують інтерферон в тих випадках, коли такими антигенами виявляються віруси.
Інтерферон неспецифічних, він універсальний, діє не вибірково проти якогось вірусу, а захищає організм від будь-яких вірусів. Як відомо, організм для захисту від антигенів виробляє високоефективні антитіла. Антитіла виробляються лише певними клітками імунної системи і діють проти вірусів строго вибірково. Антитіла, що захищають організм від одного вірусу, у відповідь на впровадження якого вони утворилися, виявляються безсилі проти іншого вірусу.
Крім того, антитіла "зачинають поступати в кров лише через декілька днів після зараження. Незліченні полчища нових вірусів утворюються набагато швидше, і захисні тіла можуть попросту не встигнути". Інтерферон же захищає організм вже в перший годинник після зараження " поки не підтягнуться основні захисні сили - антитіла, направлені вже безпосередньо проти вірусів, що вторглися".
Клітка, уражена вірусом, виділяє інтерферон як противірусну речовину до сусідніх кліток, мобілізуючи їх на боротьбу з вірусом, що розмножується. Інтерферон безпосередньої дії на вірус не надає, і це не дозволяє вірусу пристосуватися до інтерферону, виробити проти нього резистентність (опірність).
Встановлено, що інтерферон не проникає в клітку, а зв'язується з особливими рецепторами на мембрані цитоплазми. Інтерферон впливає на мембрани клітки, що виділила його, і сусідніх кліток. З'єднуючись з рецепторами мембрани, інтерферон викликає внутріклітинну продукцію речовин, що пригнічують розмноження вірусів, впливає на апарат клітки так, що вона стає непридатною для розмноження вірусів.
Уражена вірусом клітка гине із-за проникнення в неї вірусу, але при цьому підсилює захист сусідніх кліток від вірусів. Що виділяється гинучою кліткою інтерферон переслідує віруси, захищаючи сусідні клітки. Після контакту з інтерфероном кожна клітка гине разом з вірусом, що проник в неї, але вірус при цьому не залишає потомства. Інтерферон, виділений ураженою кліткою, потоком крові розноситься по всьому організму і активізує захисні реакції.
Інтерферон - надійний захист від вірусів. Антитіла крові знищують віруси поза кліткою, знешкоджують віруси шляхом з'єднання з ними. Інтерферон же діє лише внутріклітинний, викликаючи руйнування генетичного механізму відтворення вірусу, не з'єднуючись з ним. Інтерферон захищає організм практично від всіх вірусів.
Універсальність інтерферону в боротьбі з вірусами породила надію на можливість використання його як перспективний засіб захисту від вірусних захворювань, оскільки антитіла зазвичай утворюються лише в кінці вірусного захворювання.
У наш час відоме близько 500 різних вірусів, здатних викликати захворювання людини, у тому числі і злоякісні. Створення дієвих вакцин проти вірусів практично неможливе, оскільки віруси легко піддаються мутаціям, в результаті яких вакцини перестають діяти.
Інтерферон проявляє своя дія з типа каталізатора: в процесі контакту з клітками витрачається нікчемно мала його кількість. Але інтерферон не є каталізатором. У спеціальній літературі можна зустріти повідомлення про велику потенційну силу інтерферону, про те, що одна його молекула здатна захистити від вірусної інфекції декілька тисяч кліток. Подібні заяви абсурдні, оскільки кожен спеціальний рецептор на клітинній мембрані з'єднується, принаймні, з однією молекулою інтерферону. І ця молекула ефективно спрацює лише в тому випадку, якщо в цю ж клітку проникне вірус.
Віруси все ж хитріше і мобільніше. Проте інтерферон істотно не збільшує захищеність людей, наприклад, від грипу. Вичерпного пояснення цього явища поки немає. Швидше за все, причина криється в перебільшенні можливостей інтерферону і недооцінці можливостей вірусів. От як малює картину що відбувається в організмі відомий фахівець, доктор медичних наук А. А. Смородінцев (1983): "Період утворення багатьох тисяч молекул інтерферону набагато менший, ніж час породження вірусного потомства. А раз так, клітка встигає випередити агресора і побудувати оборонні споруди". Але ж це явна фальсІФікація подій. Насправді спостерігається прямо протилежна картина. У будь-якому керівництві по мікробіології можна знайти барвистий опис розмноження вірусів, при якому з ядра гинучої клітки, в яку упровадився вірус, через 20 хвилин висипаються 100 свіжих вірусів, нащадків першого. Протягом години з моменту впровадження в клітку першого вірусу всі ці 100 вірусів можуть дати кожен по 100 вірусів, їх стане 10000, та ще ці віруси встигнуть дати по 100 нащадків кожен.
Віруси - це не живі клітини, їм не потрібно витрачати час на дозрівання, на проходження диференціювання. За годину з невеликим в організмі з одного-одного вірусу може опинитися мільйон нащадків!
А інтерферону ще немає, він з'являється лише "в перший годинник зараження". Ще через 40 хвилин кількість вірусів в організмі може перевалити за мільярд! Інтерферон весь цей час ще "зріє". Тому і не встигає інтерферон наздогнати віруси, що розмножуються з випередженням. Фахівці ж продовжують вибудовувати нереальні перспективи перемоги над грипом, картини переможного ходу інтерферону. Природно, повністю заперечувати противірусну дієвість інтерферону не можна, але не слід підміняти реальність домислами.
Коли інтерферон в організмі виробляється насилу. Відсутність значних успіхів в боротьбі з вірусними інфекціями при використанні інтерферону заставляє фахівців удаватися до виправдувальних пояснень, заслань на вік хворих, холодна пора року і так далі
Процес утворення інтерферону дуже складний і ще до кінця не пізнаний. Так, до цих пір невідомо, чи присутній в клітці низькомолекулярний білок до проникнення в неї вірусу. З упевненістю можна сказати лише, що кількість інтерферону зачинає наростати відразу після порушення вірусом кордонів клітки.
Дослідженнями встановлено, що у дітей до трьох років і у літніх людей (старше 60--65 років) інтерферон утворюється повільніше і в менших кількостях. Але і в цих вікових групах люди по-різному реагують на контакти з вірусами.
Менш інтенсивно інтерферон продукується клітками слизистої оболонки верхніх дихальних шляхів і в холодну пору року. Ці дані можуть частково пояснити зростання захворюваності людей вірусними інфекціями в цей час роки і важча течія їх у маленьких дітей і літніх людей.
Захисний ефект інтерферону знижується, якщо людина ослаблена перевтомою, нервовими переживаннями, хронічними захворюваннями.
Вироблення інтерферону організмом має індивідуальні відзнаки, що накладають відбиток і на противірусну його відповідь.
Не обходиться без курйозів. У пресі можна зустріти знервовані відгуки людей з приводу неефективності інтерферону у випадках, не пов'язаних з вірусною інфекцією (переохолодження і т. п.). Інтерферон, що рекламується як найсучасніший і найдієвіший засіб в боротьбі з грипом, природно, в таких випадках не допомагає.
Інтерферон утворюється не лише в клітках організму, але і поза ним, в клітках, що культивуються ізольовано від організму. Це дозволило організувати виробництво інтерферону спочатку для лікувальних, а потім і для профілактичних цілей.
В спеціальній літературі цінність інтерферону як лікувального препарату убачається в його повній нешкідливості для організму навіть в дуже великих дозах. Проте у великих дозах інтерферон не нешкідливий. Повну нешкідливість інтерферону для організму спростовує А. Балаж (1987): "...необхідно згадати про широко відомі інтерферони. Незабаром після відкриття інтерферону учені зрозуміли, що поряд з противірусною активністю він володіє ще здатністю пригнічувати проліферацію (розростання. -- М. Же.) кліток... Якщо докласти багато зусиль, можна використовувати його протипухлинну активність. Але, на жаль, він пригнічує проліферацію кліток всіх типів, без розбору".
Що стосується антивірусної активності інтерферону, то, як вже мовилося вище, вона виявляється не відразу, а лише через декілька годинників після того, як вірус впливає на клітку. За цей час вірус встигає ґрунтовно закріпитися в організмі, розмножуючись дуже швидко і випереджаючи дію інтерферону.
Інтерферон практично не припиняє розвитку вірусної інфекції, він лише ослабляє її розвиток. Інтерферон швидко виводиться з організму. При парентеральному введенні інтерферон дуже швидко інактівіруєтся (період напіврозпаду близько 20 хвилин). Тому для профілактики, а тим більше для лікування вірусних інфекцій потрібна велика кількість цього препарату і часте його введення.
І часто малоактивний. Інтерферон, що випускається для лікувальної мети, у ряді випадків виходить малоактивним і не виправдовує надій, що покладаються на нього. Необхідне збільшення активності в багато сотень разів. Кращі зразки інтерферону масового виробництва мають таку активність.
А. Балаж (1987) про інтерферон: "Це не однорідна речовина, а група речовин, молекулярна маса якої укладається в інтервалі від 1,2 х 104 до 6,7 х 104. Хоча інтерферон і був відкритий в 1957 р., очистити його до гомогенного (однорідного. -- М. Же.) достатку удалося лише до 1976--1978 рр. Тоді ж визначили його амінокислотний склад... Коли інтерферон відкрили, з 1 мл суспензії кліток витягували всього 10 МЕ інтерферону, а зараз -- 100 000!"
Ведеться пошук засобів, які змусили б клітки проводити більше власного (ендогенного) інтерферону, подібно до того, як це робиться з екзогенним інтерфероном. Пошук препаратів-індукторів (інтерфероногенов), у тому числі синтетичних імітаторів вірусів, не привів до отримання речовин, придатних для медичної практики.
Поза організмом людини екзогенний інтерферон отримують з лейкоцитів донорської крові, оскільки ефективний лише інтерферон, що витягує з людських кліток. У спеціальній літературі приводилися відомості, що для отримання однієї дози інтерферону доводиться витрачати до 1 л донорської крові. Розроблені способи очищення інтерферону від баластних білків і отримання концентрованого високоактивного інтерферону, який декілька успішніше застосовується як лікувальний і профілактичний засіб.
Ставиться завдання збільшення тривалості дії інтерферону. Ефект його кратковремен, препарат доводиться вводити багато разів впродовж курсу лікування, і це не дозволяє використовувати його в досить широкій практиці. Стимуляція вироблення інтерферону в організмі нешкідливими жвавими вакцинами поліомієліту, грипу, свинки продовжується всього 5--7 днів.
Міф про антирадіаційну панацею. З'явилося повідомлення професора Р. Д. Засухиной, (1985), про те, що інтерферони захищають людські клітки, що культивуються в пробірці, від дії швидких нейтронів і від гамма-випромінювання. Клітки, заздалегідь оброблені інтерфероном навіть в невисоких концентраціях, не лише виживають після опромінення, але і майже повністю запобігає шкідлива дія швидких нейтронів на структуру їх хромосом. Так, в наші дні представляється можливим створити сенсацію про антирадіаційну панацею. Здавалося б, тепер досить обробки інтерфероном - і людині не загрожує радіація. Або, ще того простіше - людина заразилася грипом, і йому вже не страшна жодна радіація.
2.2 Механізм впливу інтерферону на біохімічні процеси
В основі методу визначення активності ІНФ лежить ігибирування ним цитопатичної дії вірусів. Класичним методом кількісного визначення ІНФ вважається титрування його в КК проти ВВС, штам «Індіана». За одиницю активності прийняте розведення, що захищає КК від вірусного цитопатичної дії в 50 % випадків при титруванні проти 100 ТЦД SO ВВС. Специфічну дію виражають в інтернаціональних одиницях на міліграм протеїну. Його порівнюють із міжнародними стандартами. Після концентрації й очищення біологічна активність більшості ІНФ може досягати 2 -х од. на 1 г протеїну. Запропоновано ряд модифікацій цього методу. Вибір кількісного визначення ІНФ залежить від цілей дослідження й технічних можливостей.
При порівнянні методів титрування ІНФ, заснованого на інгибуванні ЦПД тест-вірусів у пробірочних культурах і мікрокультурах клітин при утворенні в них вірусних бляшок або зниженні рівня гемадеорбції, обумовленої ВБН, найбільш високі титри були отримані при титруванні ІНФ у мікрокультурах з використанням вірусів Сиядбис і ВВС. Титрування ІНФ у пробірках і мікрокультурі більш просто, а використання методу гемадсорбції дозволяє одержувати результати в більш короткий термін. Титрувати ІНФ у ЮС по інгибуванню ЦПД рекомендують при масовому дослідженні проб ІНФ.
РОзроблен простий метод титрування ІНФ у КК, заснований на визначенні рівня позбавлення ними фарби (1 %-ний розчин нейтральрота, 0,5 %-ний кристалвиолета). Модифікований спектрофотометр дозволяє враховувати результати шляхом виміру рівня поглинання фарби клітинами безпосередньо в КК, а лунках на мікропанелях. Використання цього методу дає можливість автоматизувати титрування й застосовувати для обліку даних комп'ютер.
Мікротитрування ІНФ із використанням чутливих клітин проводять із ВВС, міченим радіоактивним Н-Уридином. За одиницю активності приймають максимальне розведення ІНФ, що інгибує 50 % інкорпорацію Н-Уридина вірусну РНК. Титри ІНФ при використанні радіоактивної мітки високовиробничі. Метод рекомендується для масового дослідження зразків ІНФ.
У розробленому непрямому методі раднонммунологічного визначення ІНФ у КК із використанням AT до індикаторного вірусу, мічених радіоактивним йодом, наявність ІНФ визначали по придушенню експресії АГ індикаторного вірусу в порівняння з контрольними. Метод дозволяє визначати ІНФ у концентрації 5 од./мол і вимагає малої кількості матеріалу. Кількісне визначення проводили методом ІФА.
У досвідах показана можливість кількісного визначення ІНФ за допомогою мічених флюоресцеинизотиоционатом антиннтерферонових AT у прямій і непрямій реакціях імунологічної інгибіції флюоресценції.
Для оцінки противірусної активності ІНФ різних типів широко використовують монокональні AT. Цей високочутливий метод дозволяє виявляти ІНФ у концентрації 2 ед./мол.
Якісне й кількісне визначення змісту ІНФ можливо шляхом визначення ферментів протеинкинази, олигоаденнлатсинтетази або фосфодиэстерази, зміст яких залежить від дози ІНФ.
Дослідниками розроблені методи кількісної оцінки антипроли-фератямого дії ІНФ. Вони засновані на безпосередньої візуальній (під мікроскопом) оцінці впливу різних доз ІНФ на проліферацію й колоніеобразованіе пухлинних клітин, що перевиваються. Придушення росту клітин і цитотоксичний ефект ураховують візуально. При фотоколориметрії облік ведуть по щільності алюированного розчину барвника.
Зв'язок інтерферону й імунітету
У цей час розроблена модель участі ІНФ у противірусному захисті організму: віруси - клітина - ІНФ - лейкоцити - лімфоцити. Вона пояснює деталі кооперативної участі різних факторів імунітету. Ефект ІНФ в організмі зв'язаний не тільки з інгибірованнням розмноження «ярусів шляхом придушення транскрипції або трансляції інформації в чутливих клітинах, але й опосередковано - через взаємодію з іншими захисними механізмами.
ІНФ впливає на різні біологічні процеси в організмі: підсилює активність лімфоцитів і макрофагів, чутливість клітин-мішеней, зв'язування лімфокинів з рецепторами клітин.
Інтерферонообразованіе розглядається як загальбіологічне явище, що відбувається в найрізноманітніших типах клітин. Продукція ІНФ є одним з механізмів ауторегуляціи клітини. При втраті клітинами здатності синтезувати ІНФ можливо їхнє злоякісне переродження. Показано, що інтерфероногенез лежить в основі будь-якої імунологічної реакції, а інтерферон - це білок-переносник, у якому закодована специфічна імунологічна інформація. Система ІНФ служить для підтримки генетичної сталості організму, безпосереднього виявлення НК, елімінації чужорідної генетичної інформації.
Різноманіття виявлених і вивчених до теперішнього часу фізіологічних функцій ІНФ із безсумнівністю вказують на їхню контрольно-регуляторну роль у збереженні гомеостазу. Основні ефекти; противірусний, антимікробний, антипроліферативний (у т.ч. антитуморогенний), іммуномодулирующий, радиопротективний і ін.. По вагомості ця система порівнянна із системою імунітету, а по універсальності навіть перевершує її. Система, що контролює нуклеїновий гомеостаз (ІНФ) вірогідно впливає на систему, що забезпечує білковий гомеостаз (імунітет) і зворотна дія (зниження ИР Л, отримане від хворих зі зниженої іммунорективністю).
Таким чином, ІНФ як би поєднує фактори клітинного й гуморального імунітету й робить їхньою єдиною системою, що лежить в основі імунних реакцій організму.
2.3 Характеристика сировини
Немає необхідності давати характеристику всім групам ІМД, застосовуваних у ветеринарії. Доцільніше зупинитися лише на перспективні. При цьому ми відступимо в деякій мері від наведеної вище класІФікації ІМД. А об'єднаємо їх по цільовому призначенню й походженню.
1. Адаптогени
Речовини, здатні стимулювати резистентність організму, одержали назву адаттгогенов. Дослідження останнього років показали, що більшість цих препаратів володіє трьома типами дії: антистрессорне, детоксицируюче, іммуноститмулирующе.
Усе компоненти цих препаратів діють системно, у різних сторонах організму, створюючи сумарний ефект. Крапкою додатка їх в організмі можуть бути енергетика клітини, активність ферментів цитохромов групи Р-450, що переробляють чужорідні речовини, синтез РНК і білка.
Мінливість складу адаптогенов рослинного й тваринного походження спричиняється пошук препаратів з відомою хімічною будовою. № засобів для корекції імунітету у ветеринарії рекомендують: дибазол, метилурацил, кватерна, фумаровую кислоту.
2. Полісахариди
Число повідомлень про вивчення різних липололісахаридов (ЛПС) продовжує стрімко наростати. Особливо інтенсивно вивчаються ЛПС грам-иегативних бактерій, в оболонці яких утримується до 15-40% ЛПС. Останні впливають на клітинні мембрани лімфоцитів і макрофагів, що приводить до змін у балансі цитоплазматичних нуклеотидів.
З бактеріальних полісахаридів у медицині в цей час більше широке застосовуються пирогенал і продигиозан .
3. Нуклеинові кислоти й синтетичні полинуклеотиди Дріжджова РНК є важливим джерелом вихідних речовин для синтезу біологічно активних препаратів (нуклеотиди і їхні аналоги), а її сіль - нуклеинат натрію володіє іммуномодулирующими властивостями. Нуклеїнах натрію підвищує рівень противірусного імунітету, прискорює його формування при активній імунізації, робить позитивний вплив при лікуванні хворих різними формами пневмонії, усуває в них імунодефіцит по Т-Т- і У-лімфоцитах і Ig, поліпшує репаративні процеси, стимулює метаболізм і підвищує детоксицируючі властивості організму. Препарат підвищує в людини й тварин зміст лізоциму, пропердина, беталізиного й нормального антитіл, активізує фагоцитарну активність лейкоцитів. Нуклеинат натрію показаний при стимуляції первинної й повторної відповіді на різні антигени: при сальмонельозі телят, сальмонельозі, хворобі Ауески й лептоспірозі свиней.
НеспецІФічними стимуляторами імунної системи організму є синтетичні двухцепочечні полинуклеотиди - полииц, полищ, поліагов. Іммуномодулируючі властивості полииц пов'язані з підвищенням синтезу інтерферону лімфоцитами (інтерфероноген), збільшенням активності Т-Хелперов і зміною активності антитіл. Крім того, полинуклеотиди стимулюють макрофаги, інгабируют ріст пухлин і підсилюють різні прояви клітинного імунітету у тварин і людини.
4. Похідні імидазола.
До цієї групи іммуностимуляторов ставиться левамизол, дибазол, изопринозин і кобальтсодержащие похідні імидазола.
Левамизол - ефективний противоглистний препарат, вплив його на імунологічні процеси було виявлено пізніше. Його іммуномодулируюшие властивості пов'язані зі змінами проліферації, міграції й секреторній функції лімфоцитів, макрофагів, нейтрофилов. Левамизол стимулює процес дозрівання попередників Т-Лімфоцитів у зрілі Т-Лімфоцити, збільшує продукцію цитокинов і підвищує кількість Т-Хелперов відносно Т-супрессоров. Він не робить прямого впливу на утворення антитіл, але підсилює клітинна імунна відповідь у пацієнтів з иммувосупрессией. На здорових тварин левамизол не робить впливу. Побічні реакції левамизола: шлунково-кишкові розлади в 90 % випадків, збудження центральної нервової системи, алергійні шкірні висипання, слабість.
Дибазол - препарат, що має властивості адаптогена, стимулює гліколіз, синтез білка, нуклеїнових кислот. Застосовується частіше із профілактичної, а не з лікувальною метою. Зменшує сприйнятливість до інфекцій, викликуваним стафілококами, стрептококами, пневмококами, сальмонеллами, рнккетсиями. Дибазол стимулює утворення інтерферону в клітинах, ефективний при деяких вірусних інфекціях
5. Цитомедини
В 80-х роках 20-го сторіччя сформувалося подання про новий клас інформаційних молекул - цитомединах, специфічних біорегуляторах у популяціях клітин організму. Вони підрозділяються на ембріональні медіатори, фактори росту, кейлони, пептидні гормони й регуляторні пептиди.
У нормі цитомедини регулюють фізіологічні процеси, отже, при патології відновлення їхньої функції має важливе значення. Найбільший інтерес представляють препарати, виділені з тимуса, а також синтетичні фрагменти, що модулюють їхній активний центр.
Підставою для застосування цих препаратів з'явилися дані, отримані в останні 20-30 років, про центральну роль тимуса й пептидних факторів, синтезованих цією залозою, у функціонуванні імунної системи. Установлено, що різні порушення функцій тимуса й синтезу тимических факторів приводять до виникнення іммунодефицитних станів Оскільки тимусу при виникненні захворювань приділяється значне місце, не випадкове широкий інтерес до препаратів, одержуваним із цієї залози. Питання одержання, очищення я вивчення біологічної активності різних препаратів тимуса узагальнені в численних публікаціях. У рамках огляду немає необхідності приводити повний перелік препаратів з тимуса, яких налічується кілька десятків. Найбільш вивченими у фізико-хімічному в біологічному відношенні є тимозин, тимопоэтин, ти-мостимулин, тималин, Т-Активин, тимотропин, сироватковий тимический фактор, тимический гуморальний фактор.
Показано ефективність застосування гомогеиата тимуса для підвищення загальної резистентное™ телят і поросят, екстрактів тимуса для лікування ІД у великої рогатої худоби й коней.
Великий інтерес представляють охарактеризовані поліпептидні фракції з тимуса Встановлено, що тимотропин усуває Т-Іммунодефицитное стан у телят при комплексному лікуванні бронхопневмонії. Інший тимусний препарат Т-Активин забезпечував видужання телят при ОРЗ на 5-7 день, а в групі, де використовували антибіотик левоэритроциклин, - на 15 день.
До цитомедииам належить ще одна більша група препаратів - интерлейкини COS).
Компоненти системи IL координування залучені в регуляцію імунної відповіді й інтегровані в цитпкиниую мережа. Існує тісний функціональний взаємозв'язок систем IL з нервовою й ендокринною системами.IL-1 активує Т-, B-t воявморфонуклеари, клітини эндотелия, хондропити, остеокласти, фібробласти, тиреоцити, бета-клітини, гепатоцити; IL-2 підсилює ріст Т-Т-, В-, NK-Клегок; IL-3 — активує гемопоэтические, гладкі клітини, полипоэтин; IL-4 — підсилює ріст Т-Т- і У-клітин, пов'язаний з Ig-Відповіддю; IL-5 -підсилює дІФференцировку эознвофилов і В-Клітин; JL-6 - підсилює кінцеву дІФференцировку В-Клітин; IL-7 - активує дІФеренціацію стовбурівих лимфоидних клітин кісткового мозку, Т-Т- , У-клітини й тромбоцити; IL-8 -хемоатграктант для нейтрофилов, Т-Лімфоцитів і моноцитів; IL-10 - активує Т-Киллери й тимоцнти, ингибирует Т-Хедпери типу 1.
Наступний представник цитомединов - інтерферон (IFN).
Дія ІНФ далеко не вичерпується його противірусною активністю й антибластомим ефектом. Добре відомо його іммуномодулируюча дія. ІНФ модулює активність клітин імунної системи шляхом активації макрофагів, стимуляції В-Клітин і підвищення захисних властивостей природних киллерих і щлотоксических Т-Клітин. Більш докладно на ньому зупинимося нижче .
6. Опіоидні пептиди
Опіоидні пептиди, синтезовані гіпофізом (эндорфини) і надпочечниками (энкефапини), також роблять стимулюючу дія на функції лімфоцитів. Взаємодія поверхневих рецепторів лімфоцитів із цими пептидами приводить до модулювання внутрішньоклітинного рівня циклічних нуклеотидов і в такий спосіб збільшує проліферацію Т-Т- і У-клітин. Крім того, вони можуть підтримувати рівень імунної відповіді, сприяючи Т-Т- і У-клітинної кооперації. Є дані про те, що эндорфини й энкефалини разом з адренокортикотропними гормонами полегшують стресову реакцію організму.
7. Препарати з вірусів
Із препаратів цієї групи застосовуються PIND-QFR і P1 ND-AVI, що представляють відповідно инакгивированний штам парапоксвируса овець і поксвируса птахів Обидва препарати активізують фагоцитоз, стимулюють лімфоцити, викликають утворення й вивільнення ендогенного ІНФ.
Новий іммуностимулятор POLI-IF являє собою суміш інактивиро-ванного очищеного вірусу хвороби Ньюкасла з эндотоксином, екстрагованим із клітин Е. ooli, і неповного адиованта Фрейнда. Препарат индуцирует утворення циркулюючі в організмі телят ІНФ із піком через 12 і 24 години й збільшення в 2 рази змісту лейкоцитів
8. Вітаміни
Вітаміни, будучи коферментами або їхньою частиною, завдяки своїй ролі в обмінних процесах, роблять досить значний вплив на функції різних органів і систем організму, у тому числі й на системи імунітету. Надзвичайно широке використання вітамінів, часто в дозах, що істотно перевищують фізіологічні, робить зрозумілим інтерес до їхнього впливу на імунітет.
Відомий ще один великий клас модифікаторів імунної відповіді - синтетичні поліелектроліти, які володіють іммуностимулирующими властивостями й потужними адювантними потенціями, виявлені Р.У Петровим, P.M. Хаитовим. Деякі із цих препаратів уже стали офіційними (полиоксидоний).
Таким чином, поруч дослідників уживали спроби використовувати іммуностимулирующие речовини, що впливають на імунну систему тварин при хворобах молодняку КРС, свиней і в птахів. Багато хто із препаратів, незважаючи на те, що вони володіли іммуностимулирующим дією, не знайшли широкого застосування через те, що індуцировали іммунодепрессию при правильному дозуванні або дачі препаратів на певній стадії патологічного процесу (левамизол, тиабендазол). Авридин, индуцирующий синтез ІНФ, викликає у тварин лихоманку й місцеву запальну реакцію.
Коло іммуностимуляторов надзвичайно широке, і проте їхній вибір не повинен носити випадковий характер. При виборі іммуностимулирующих препаратів у кожному конкретному випадку потрібно враховувати той факт, що іммуностимуляція означає посилення імунологічних реакцій і може бути спецІФічн або неспецІФічної й відповідати або активації певного клону клітин, або загальному посиленню імунологічного захисту. Спосіб іммуностимуляциї залежить від характеру порушень в імунній системі.
При цьому необхідно ще раз відзначити й ураховувати, що самі по собі вакцинні препарати мають здатність поряд зі специфічною імунною відповіддю модулювати неспецифічні зміни в імунній системі. Характер зрушень у ній залежить від властивостей вакцинного препарату, тобто його антигенної структури, фізичних властивостей, дози, кратності ампліфікації, а також від стану макроорганізму.
Таким чином, можна укласти, що оскільки фізіологічний стан тварини є визначальної, і залежить насамперед від умов змісту й годівлі, то при незадовільному змісті й неповноцінній і незбалансованій годівлі використання іммуностимуляторов не є ефективним і економічно доцільним. Цим, очевидно, пояснюється те, що кількість робіт, що розглядають цю проблему у ветеринарії незначно, а позитивні результати лабораторних випробувань не знайшли широкого застосування у тваринництві. Тому існує думка, що проблема використання іммуностимуляторов більше застосовна до окремих індивідуумів, ніж до великої популяції тварин (Гусєва Е.В. і ін., 1994).
На російському фармацевтичному ринку в цей час представлені наступні вітчизняні й закордонні препарати із групи иммуномодуля-торів: Байпамун («Байер АГ», Німеччина), Иммунофан («Біоніці», Росія), Риботан («Ветзвероцентр», Росія), Неотим («Веда», Росія), Мастим, Достим, Иммунофор, Иммунопаразитан («НИЦ Ігнатова», Росія).
Оскільки в багатьох іммуномодуляторов, як відзначено вище, іммуностимулирующий ефект пов'язаний з індукцією ендогенного інтерферону або самі вони є високоактивними интерфероиогенами (препарати з вірусів, пирогенал) шш препаратами екзогенного інтерферону (рекомбинантний інтерферон), системі інтерферону і його препаратів і індукторам приділяють у цей час велика увага.
2.4 Схема отримання інтерферону
Фактори, що впливають на утворення інтерферону
Інтерферон здатні виробляти живі клітини практично всіх теплокровних тварин, що плазують, риб, членистоногих. При взаємодії вірусів і рослин клітини останніх також виділяють речовини типу ІНФ. Отримано перевиваються линии, що, лимфобластов, спонтанно утворюючі ІНФ.
У цей час уважається загальновизнаним, що клітини РЭС (селезінка, клітини кісткового мозку) є найбільш активними продуцентами ІНФ. Рівень інгерферонообразуваня визначається приналежністю клетоковище до різних видів організмів. Певну роль у здатності клітин (лейкоцитів) до інтерферонообразованню грає тільність корів, сезон року, індивідуальні особливості організму. Виявлено залежність здатності клітин виробляти ІНФ від віку організму, у якому йде процес інтерферонообразування, або аз якого виділені клітини.
ІНФ виробляється при гострій, латентній і хронічній інфекції клітин. Латентний тип інфекції культури тканини є оптимальним для одержання більше високого виходу ІНФ. Передбачається, що ІНФ проявляє свою дію й при латентній інфекції в організмі тварини й людини.
Немаловажне значення для процесу інтерферонообразування грають різні фактори навколишнього середовища, наприклад температура. Дані про вплив температури на вихід ІНФ суперечливі. У діапазоні температур 35-41°З виникає проблема співвідношення між розвитком вірусу й продукцією ІНФ. Температура, оптимальна для вірусу, видимо, є оптимальною й для продукції ІНФ.
Продукція ІНФ може бути збільшена при впливі фізико-хімічних і біологічних факторів за рахунок більше ефективного прикріплення індуктора до рецепторів клітини й придушення репрессоров ІНФ.
Збільшення виходу ІНФ досягається шляхом попередньої обробки клітин невеликою кількістю ІНФ ( прайминг-ефект). Продукція ІНФ починається раньше, чим у контролі, або одночасно. Підвищена продукція ІНФ пов'язана з активацією адеиилатциклазной системи клітини. Синтез ІНФ можна підсилити, використовуючи метод суперіндукції. Він заснований на введенні після індукції інгібіторів синтезу білка й РНК (актиноміцин, циклогексимид, дигидроряфампицин).
В організмі тваринний процес ікгерферонообразования може бути пригноблений різного роду стрессорами (голодуванням, травмами, що супроводжують інфекціями й т.п.). Зниження здатності продуцировать ІНФ спостерігається після обробки у-променями. Доведено гнітючу дію на продукцію ІНФ різних канцерогенів, ароматичних многоядерних вуглеводнів, урета-на, кортизону і його похідних. Гальмують синтез ІНФ солі важких металів.
Продукція ІНФ у КК залежить від методу культивування. При роллерном і суспезионном культивуванні клітин-продуцентів вихід ІНФ підвищується в 2-10 разів .
На перших етапах дослідники використовували ІНФ, індукований у КК бруньки ембріонів або дорослих тварин. Так, був отриманий у досить більших кількостях ІНФ КРС (В.А.Сергєєв, 1960), свиней. Судячи з описаних властивостей, це були Р-ІНФ.
Практичний інтерес відносно одержання ІНФ мають клітини лимфоїдної тканини. Виявилося, що лейкоцити тварин активно продуцирують ІНФ у відповідь на вплив вірусних індукторів, високо- і низькомолекулярних природних і синтетичних з'єднань, митогенов, різних продуктів мікробного походження. Були отримані лейкоцитарні ІНФ курей, кроликів, КРС, свиней і інших тварин, установлені основні закономірності біосинтезу, розроблені промислові технології одержання ІНФ.
Загальна схема одержання природних ІНФ с.-х. тварин складається з декількох стадій: виділення клітин-продуцентів, індукції, біосинтезу, відділення клітин продуцентів від интерферонсодержашей рідини, інактивації індуктора, очищення й концентрації ІНФ. Методика одержання різних видів ІНФ неоднакова.
Для промислового одержання а-ІНФ застосовуються лейкоконцентрат, що містить всі типи лейкоцитів, як індуктори интерферонообразова-ния - вакцинний штам.
р-ІНФ виробляється фібробластами або епітеліальними клітинами у відповідь на введення вірусних і синтетичних індукторів. Промислове одержання Р-ІНФ лімітоване вибором диплоидной клітинної культури, свободной від контамінації микоплазмами, бактеріями, вірусами, при одержанні р-ІНФ широко використовують метод суперіндукції.
Процес одержання в-ІНФ має деякі особливості. Як індуктори застосовують конканавалин А, фитогемагглютинин і лектин сочевиці, спиртні екстракти насінь квасолі, гороху, стафилококковий эндотоксин. Продуцентами в-ІНФ є збагачені популяції Т-Лімфоцитів.
Промислове виробництво ІНФ здійснюється в стаціонарних, роллерних культурах і ферментерах. Як вихідна сировина використовують лейкоцити перІФеричної крові, лимфоидні клітини селезінки, кісткового мозку, лімфатичних вузлів, молозива, амніотичну оболонку, плаценту, різні типи культур клітин, що перевиваються.
Важливе значення при виробництві ІНФ має склад живильного . середовища У перших досвідах по одержанню ІНФ із лейкоцитів крові використовували живильні йз середовища додаванням плазми крові. Надалі плазму замінили сироваткою крові. До складу живильних замість середовищ сироватки й плазми можна включати аминопептид, гемогидролтат, амниотичну рідина. Використовують також спрощені живильні , середовища сольові розчини представляють, що собою збалансовані.
Великомасштабне виробництво ІНФ вимагає розробки оптимальних технологій для кожної стації, зниження витрат праці, витрати засобів на встаткування, живильні й з т.п.
Одним з перспективних напрямків пошуку джерел одержання ІНФ тварин стало використання методів генної інженерії. Гени лейкоцитарного, фибробластаого в ямммунного ІНФ клонують і экспрессируют у мікробні клітини, одержуючи, мікробний продуцент того або іншого ІНФ. Методами генної інженерії вдалося одержати бактерії, які здатні синтезувати до 5 мг ІНФ розраховуючи на 1 л бактеріальній суспензії. Це в 5000 разів більше, ніж його одержують із 1 л крові донора. Спектр клітин-продуцентів, s які можна клонувати гени ІНФ, постійно розширюється.
В організмі тварин установлені крапки, де відзначені постійні рівні ІНФ. Це лімфатичні вузли шлунково-кишкового тракту й органів подиху, що, видимо, обумовлено постійним контактом з різного роду індукторами - вірусами, бактеріями й т.п.
Продукція ендогенного ІНФ в організмі тварин багато в чому залежить від фізіологічного стану організму й умов зовнішнього середовища, а також від віку, індивідуальних особливостей і ряду інших факторів. Виражений вплив на продукцію ІНФ робить вплив іонізуючої радіації. Введення екзогенного ІНФ і індуктора ІНФ підвищувало захищеність тварин від різних видів опромінення.
Інтерферон і видужання від вірусних інфекцій
Є прямий зв'язок між утворенням ІНФ і видужанням, оскільки найбільша його продукція відзначається в гострий період розвитку інфекції, що передує формуванню специфічного імунітету. ІНФ з'являється в перші дні після інфікування, а антитіла - через кілька днів, коли кількість вірусу в організмі значно зменшується. Це підтверджено результатами численних досліджень. У той же час іноді відзначається й розвиток легальної інфекції, незважаючи на високий рівень ІНФ у крові. Очевидно, ефективність противірусної дії ІНФ визначається я особливостями патогенезу захворювання, коли в безпосереднім оточенні заражених клітин створюється на якийсь період часу висока концентрація ІНФ і прискорює


Другие работы по теме: