Contribution to International Economy

  • Ферменты

СОДЕРЖАНИЕ

 

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, СОКРАЩЕНИЙ И ТЕРМИНОВ……………………………………………….3

ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………..5

1. Литературный обзор………………………………………………………..7

1.1 Ферменты как биологические катализаторы …………………….7

1.2 Характеристика амилаз…………………………………………….11

1.3 Клиническое значение определения активности амилазы в сыворотке крови…………………………………………………………………14

1.4 Методы определения активности амилазы………………………..17

1.4.1 Амилокластические методы……………………………….17

1.4.2 Глюкокластические методы ………………………………19

1.4.3 Хромогенные методы……………………………………..21

1.5 Расчеты ферментативной активности……………………………..29

2. Экспериментальная часть…………………………………………………..34

2.1 Аппаратура и материалы………………………………………….34

2.1.1 Приборы…………………………………………………...34

2.1.2 Посуда……………………………………………………...34

2.1.3 Реактивы…………………………………………………...34

2.1.4 Методика приготовления растворов и измерения……..35

3. Результаты и обсуждения………………………………………………….39

3.1 Проблемы, связанные с определением активности амилазы….39

3.2 Влияние различных факторов на активность определения амилазы………………………………………………………………………...39

4. Техника безопасности……………………………………………………...43

4.1 Общие требования безопасности………………………………..43

4.2 Основные правила работы с ферментами………………………44

ВЫВОДЫ……………………………………………………………….49

Аннотация…………………………………………………………….....50

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ……………………..52

 

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, СОКРАЩЕНИЙ И ТЕРМИНОВ

 

2,4-ДНФГ – 2,4-динитрофенилгидразин;

3,5-ДХГБС – 3,5-дихлор-2-гидроксибензолсульфонат;

4-ААП – 4-аминоантипирин;

Г-6-ФДГ – глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа;

ГД – глицерол-3-фосфатдегидрогеназа;

КИГ – креатининиминогидролаза;

ЛВП-холестерин – липопротеиды высокой плотности;

ЛНП – липопротеиды низкой плотности;

ЛОНП – липопротеиды очень низкой плотности;

МДГ    – малатдегидрогеназа;

НАД (НАДН)  – никотинамидадениндинуклеотид (восстановленная форма);

НАДФ (НАДФН) – никотинамидадениндинуклеотидфосфат (восстановленная форма);

УМФ – уридинмонофосфат;

УФ – ультрафиолет;

ФАД (ФАДН2) – флавинадениндинуклеотид (восстановленная форма);

ФМН – флавинмононуклеотид;

цАМФ – циклический аденозинмонофосфат;

ЩФ – щелочная фосфатаза;

CNP – хлор-нитрофенол;

CNP-G2 – 2-хлор-4-нитрофенил-α,D-мальтозид;

CNP-G3 – 2-хлор-4-нитрофенил-α,D-мальтотриозид;

EPS – 4,6-этилиден(G7)-р-нитрофенил-(G1)-α,D-мальтогептаозид;

ЕТ-G2 – 4,6-этилиден(G2)-мальтозид;

ЕТ-G3 – 4,6-этилиден(G3)-мальтотриозид;

ЕТ-G5 – 4,6-этилиден(G5)-мальтопентаозид;

G – глюкоза;

G2-p-NP – 4-нитрофенил(G1)-α,D-мальтозид;

G3 -p-NP – 4-нитрофенил(G )-α,D-мальтотриозид;

G4-p-NP – 4-нитрофенил(G1)-α,D-мальтотетраозид;

hEPES – N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-(2-этансульфоновая кислота) натриевая соль;

PIPES – пиперазин-1,4-бис(2-этансульфоновая кислота) динатриевая соль;

р-NP – пара-нитрофенол;

р-NPР – пара-нитрофенилфосфат.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВВЕДЕНИЕ

 

Представленная работа посвящена теме: «Определение активности       α-амилазы».

Проблема данного исследования носит актуальный характер в современных условиях. Об этом свидетельствует частое изучение вопросов оптимизации способов определения активности α-амилазы и эффективном практическом руководстве для получения необходимой экспериментальной базы, используемой в последних разработках данной области науки. Данная тема изучается на стыке сразу нескольких взаимосвязанных дисциплин. Для современного состояния науки характерен переход к глобальному рассмотрению проблем тематики выбора рациональных, воспроизводимых, оптимальных методов определения каталитической активности изучаемого фермента.

Вопросам исследования посвящено множество работ. В основном материал, изложенный в учебной литературе, носит общий характер, а в многочисленных монографиях по данной тематике рассмотрены более узкие вопросы проблемы определения активности α-амилазы. Нами были учтены современные условия при исследовании проблематики обозначенной темы.

Высокая значимость и недостаточная практическая разработанность выбранного нами вопроса определяют несомненную новизну данного исследования.

Данная работа направлена на исследование методов определения активности α-амилазы, влияния различных факторов на ее каталитическую активность, подбора качественных реагентов для проведения исследования, согласованного с выбором субстрата для определения активности α-амилазы, что позволяет получить более полную и подробную информацию об исследуемых методах определения активности выбранного нами фермента на данных субстратах.

На основе ранее проведенных исследований подбора оптимальных методов определения активности α-амилазы и всестороннего изучения литературных источников, а также в качестве продолжения предыдущих изучений каталитических свойств, характеристик и методов определения необходимой нам величины – каталитической активности, было целесообразным систематически исследовать методы, основанные на использовании различных субстратов, индикаторных красителей, позволяющих спектрально получить оптическую плотность растворов, содержащих исследуемый фермент и по расчетным данным определить активность α-амилазы, основываясь на выбранном нами методе исследования.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Ферменты как биологические катализаторы

 

Для организации правильной работы с ферментами (будь то определение аналита ферментативными методами, определение ферментативной активности или работа с контрольными материалами, содержащими ферменты) необходимо знать их общие свойства и закономерности действия. Поэтому представляется целесообразным сделать краткий экскурс в энзимологию – науку о ферментах – и остановиться на основных понятиях и терминах, используемых в этой области знания [2, 7].

Ферменты – это специфические высокоэффективные биологические катализаторы, синтезируемые живыми клетками. Их еще называют энзимы от греческого «en zyme» – «в дрожжах». Именно в дрожжах они были впервые обнаружены. В живом организме ферменты играют чрезвычайно важную роль, так как они участвуют во всех химических процессах, протекающих как в отдельной клетке, так и в организме в целом. Почти все они функционируют внутри тех клеток, в которых синтезируются, за исключением ферментов органов пищеварения и отдельных энзимов плазмы крови [8, 19].

Ферменты представляют собой белки с молекулярными массами от 9 до 1 000 кДа. Они могут быть построены из одной или нескольких полипептидных цепей, имеют, как правило, глобулярную трехмерную конформацию и состоят из одной или нескольких субъединиц (табл. 1).

В состав ферментов входят и небелковые компоненты, получившие название кофакторов. Это ионы металлов Ca2+, Zn2+, Fe2+, Mg2+, Mn2+, Cu2+, Cl–. В состав ферментов также входят небольшие органические молекулы, производные витаминов (НАД, НАДН, ФАД, ФМН, перидоксальфосфат и т. п.), их называют коферментами. Взаимодействие кофермента с белковым ферментом (апоферментом) отличается высокой специфичностью. Кофакторы участвуют в стабилизации третичной и четвертичной структуры ферментов, связывании их с субстратом и непосредственно в ферментативном катализе [8, 15]. Коферменты участвуют в катализе, осуществляя, например, перенос электронов, ионов водорода, СО2 и ряда химических групп (амино-, ацильных и т. п.) (Табл. 1.1).

 

Таблица 1.1

Некоторые ферменты, используемые в диагностических наборах, и их характеристики

 

Наименование фермента, шифр

Источник

Молекулярная масса, кДа

Кол-во субъединиц

Глюкозооксидаза,

1.1.3.4

Aspergillus niger

150

2

Пероксидаза,

1.11.1.7

корневища хрена

40

1

Холестеринэстераза, 3.1.1.13

поджелудочная железа крупного рогатого скота

69

1

Холестериноксидаза, 1.1.3.6

Streptomyces

lavendulea

55

1

Уреаза,

3.5.1.5

бобы канавалии

мечевидной

480

4

Уриказа,

1.7.7.3

печень свиньи

100

4

Липопротеинлипаза, 3.1.1.34

Pseudomonas sp

33

1

Глицеролкиназа,

2.7.1.30

E. coli

220

4

Глицерофосфатоксидаза, 1.1.3.21

Aerococcu sp.

70

2

Малатдегидрогеназа, 1.1.1.37

Митохондрии сердца свиньи

70

2

Лактатдегидрогеназа, 1.1.1.27

мышцы свиньи

140

4

Глутаматдегидрогеназа,

1.4.1.3

микробного

происхождения

220

1

Глукозо-6-фосфатдегидрогеназа,

1.1.1.49

Leuconostos

mesente-rioides

110

8

Гексокиназа, 2.7.1.1

дрожжи

100

 

 

Ферменты являются высокоэффективными катализаторами, они способны увеличивать скорость химической реакции в миллионы и миллиарды раз. Так, например, уреаза ускоряет гидролиз мочевины в 1014 раз. Без участия ферментов химические реакции в живом организме протекают настолько медленно, что практически не оказывают влияния на его метаболизм [17].

Некоторые ферменты существуют в виде нескольких изоформ (изоферментов). Изоферменты – это ферменты из одного источника, катализирующие одну и ту же реакцию, но несколько отличающиеся по своему аминокислотному составу, вследствие чего они могут иметь различный молекулярный вес и электрофоретическую подвижность, а также отличаться по своим иммунологическим и биохимическим характеристикам. В связи с этим они могут иметь различный рН-оптимум, отличаться по стабильности, способам регуляции и т. д. Например, хорошо известно, что лактатдегидрогеназа (ЛДГ) имеет 5 изоформ. Все они тетрамеры, состоящие из различных комбинаций двух типов субъединиц. Креатинкиназа (КК) включает две субъединицы и имеет соответственно 3 изоформы. Органы и ткани имеют характерный для них набор изоферментов. Распределение изоферментов ЛДГ, КК, α-амилазы в сыворотке крови важно при диагностике ряда заболеваний. В настоящее время известно около 100 ферментов, имеющих изоформы [6, 22].

Некоторые ферменты из одного источника, катализирующие одну и ту же реакцию, идентичные по своему аминокислотному составу, могут различаться конформационно. В таких случаях говорят о множественных формах фермента. Так, L-глутаматдегидрогеназа имеет множественные формы, к ним относятся и комплексные формы ферментов (ассоциации ЩФ, g-глутамилтрансфераза с ЛП-Х) [4, 10].

Вещества, с которыми происходит химическое превращение под действием ферментов, называют субстратами. Субстратами ферментов могут быть как природные, так и химически синтезированные вещества. Фермент может иметь один или несколько субстратов близких по строению [8].

Ферменты обладают каталитической активностью, т. е. способностью превращать в продукт определенное количество молекул субстрата в единицу времени, оставаясь при этом неизменными. Разные ферменты могут осуществлять от 1 до 106 циклов превращений субстрата в секунду. Например, 1 моль трипсина осуществляет 102 таких циклов в секунду, глюкозооксидаза – 17*103, а карбоангидраза – 6*105 циклов в секунду [19].

Существуют соединения, которые приводят фермент в каталитически активное состояние, – это активаторы ферментов. Ими могут быть, например, ионы двухвалентных металлов: Cu2+, Mg2+, Zn2+, Ca2+ [11, 19].

Другие вещества тормозят действие ферментов, снижают их каталитическую активность – это ингибиторы ферментов. Ингибирование может быть обратимым и необратимым, в первом случае активность фермента восстанавливается, во втором не восстанавливается (фермент инактивируется). Необратимые ингибиторы часто разрушают структуру ферментов, ими могут быть, например, катионы тяжелых металлов. Ингибиторы могут быть конкурентными (похожими на субстрат) и неконкурентными (не похожими на субстрат) [6, 7, 18]

 

1.2 Характеристика амилаз

 

Становление ферментологии как науки произошло в начале XIX века. Одним из первых открытых ферментов была α-амилаза, выделенная еще в 1814 году русским академиком К.С. Кирхгоффом. Препарат, полученный ученым из пшеничной муки, обладал способностью разжижать крахмальный клейстер и превращать его в сахарный сироп. Аналогичное явление автор наблюдал при смешивании крахмального клейстера с ячменным солодом. Уже в этих первых исследованиях Кирхгоф отметил губительное действие на это вещество серной кислоты. В то же время он подчеркнул, что сахарообразование является необходимым условием для сбраживания крахмалосодержащих материалов, и таким образом положил начало научному объяснению технологии брожения [17-19].

В 1833 году французскими учёными А. Пайеном и Ж. Персо был выделен неочищенный комплекс амилазы из солодовой вытяжки – первый ферментативный препарат. Было обнаружено, что его действие на крахмал происходит через три стадии: разжижение, декстринизацию и осахаривание. Это привело к признанию существования в солоде двух различных компонентов, которые в дальнейшем были получены в отдельности и названы α-амилазой (декстринирующий компонент) и β-амилазой (осахаривающий компонент) [9-11].

α-Амилазы и β-амилазы широко распространены в высших растениях. Наиболее важным источником амилаз являются хлебные злаки, зерно которых в проросшем состоянии (в виде солода) находит широкое применение в промышленном гидролизе крахмала. Солод из ячменя, ржи, пшеницы, овса, проса в настоящее время используются для осахаривания крахмала в спиртовом производстве [8].

Следовательно в зависимости от характера действия на субстрат различают α-амилазы, β-амилазы и γ-амилазы.

В основе принятой классификации ферментов α-амилаза (диастаза или 1,4-α-D-глюкан-4-глюканогидролаза, К.Ф.3.2.1.1.) – фермент, осуществляющий эндогидролиз α-1,4-глюкозидных связей крахмала, гликогена и родственных им полисахаридов до мальтозы, декстринов и глюкозы в организме человека (Рис. 1.1).

 

 

 

Рисунок 1.1 Структура амилазы слюнных желез. Катион кальция показан жёлтым цветом, анион хлора – зелёным.

 

β-амилазы (КФ 3.2.1.2; 1,4-α-D-глюкан-мальтогидролаза) последовательно отщепляют остатки мальтозы от нередуцирующих концов цепей полимера. При созревании фруктов               β-амилаза расщепляет плодовый крахмал на сахара, что приводит к сладкому вкусу зрелых плодов. В семенах β-амилаза активна на стадии предшествующей прорастанию, тогда как α-амилаза важна при непосредственно прорастании семени.

γ-амилазы (КФ 3.2.1.3; глюкан-1,4-α-глюкозидаза; амилоглюкозидаза; экзо-1,4-α-глюкозадаза; глюкоамилаза; лизосомальная α-глюкозидаза; 1,4-α-D-гликан-глюкогидролаза) расщепляют полисахарид с образованием свободной глюкозы. Кроме этого, γ-амилаза способна гидролизовать α-1,6-гликозидную связь. В отличие от других амилаз γ-амилаза наиболее активна в кислых условиях при pH 3 [16, 19].

α-амилаза встречается у животных, растений и микроорганизмов, β-амилаза типична для высших растений, глюкоамилаза содержится в крови животных, плесневых грибах, бактериях и др. [10].

α-Амилазы различного происхождения имеют много общих свойств: хорошо растворяются в воде или в сильно разбавленных растворах солей. Более концентрированные растворы солей (например 20-30%-ные растворы сульфата аммония) вызывают осаждение этих ферментов. α-Амилазы легко растворяются в разбавленных растворах этилового спирта, но осаждаются при его концентрации в среде свыше 60%. Белок α-амилаз обладает слабокислыми свойствами; изоэлектрическая точка ферментов колеблется в пределах рН 4,2-5,7 [12]. Молекулярная масса солодовой α-амилазы – 60000,       α-амилаз микроскопических грибов – 45000-50000. Многие из известных     α-амилаз получены либо в высокоочищенном, либо в кристаллическом виде.

Ионы кальция оказывают стабилизирующее действие на α-амилазы. Это впервые было обнаружено Воллерштейном, затем потверждено Накамурой. В настоящее время это явление отмечено почти для всех амилаз. Однако теоретически этот вопрос применительно к промышленному гидролизу крахмала до сих пор не разработан [5-7].

Наиболее богаты α-амилазой поджелудочная и слюнные железы. α-амилаза секретируется в кровь главным образом из этих органов по данным Р. Мари (1993), В.Дж. Маршала (1999). Многочисленные изоформы, выделенные из биологических жидкостей и тканей человека, представляют собой, вероятно, гетерогенные продукты посттрансляционных изменений двух семейств изоферментов амилазы, синтез которых кодируют 2 локуса гена Ату-1, слюнной (С) тип амилазы и Ату-2, панкреатический (П) тип фермента, тесно связанные в хромосоме 1. [10,18]. Изоферменты (С) и (П) не имеют больших различий в аминокислотном составе. Гель-фильтрацией на сефадексе во фракции С-амилаз выделены 2 изоформы, одна из которых содержит углеводы. Молекулярная масса изоформ, содержащих углеводы, 57 кД, не содержащих углеводы – 55 кД. Изоэлектрические точки основных изоформ С-изоамилаз от 5,5 до 6,5. П-группа изоамилаз имеет меньшую молекулярную массу      (53 кД) и не содержит углеводов. Изоэлектрические точки этих белков варьируют от 5,7 до 7,0 [17-19]

Убедительным доказательством того, что П-тип амилазы образуется только в поджелудочной железе, служит отсутствие этого изофермента у лиц с тотальной панкреатэктомией. С-изо-фермент а-амилазы, напротив, может быть синтезирован в разных органах и тканях. Высокая активность               С-амилазы зафиксирована в ткани фаллопиевых труб и содержимом кисты яичников. Специфическая группа изоамилаз, продуцируемых тканями женских половых органов, не выявляется в сыворотке крови или моче здоровых людей; распределение изоамилаз идентично у мужчин и женщин. Изоамилазы, принадлежащие к С-группе, обнаружены и в женском молоке. В раневой жидкости также содержатся амилазы, относящиеся к С-группе [10].

Определение активности α-амилазы приобретает клинико-диагностическое значение при диагностике и мониторинге заболеваний поджелудочной железы, пищеварительной системы, поражения органов брюшной полости. [4-6, 7-9].

 

1.3 Клиническое значение определения активности амилазы в сыворотке крови

 

Определение активности α-амилазы в сыворотке крови – наиболее распространенный тест диагностики острого панкреатита. При остром панкреатите активность фермента в сыворотке крови возрастает через 3-12 ч после болевого приступа, достигает максимума через 20-30 ч и возвращается к норме при благоприятном течении в пределах 4 дней. Активность               α-амилазы (диастазы) в моче возрастает через 6-10 ч после подъема активности в сыворотке и возвращается к норме чаще всего через 3 дня после подъема [8].

В настоящее время широко известно, что увеличение общей активности α-амилазы неспецифично для панкреатита и других заболеваний поджелудочной железы. Клинические исследования показали, что повышение активности α-амилазы происходит при ряде заболеваний, к которым относят кишечную непроходимость, заболевания желчных путей, аппендицит, паротит, внематочную беременность [8, 12]. Исследования активности α-амилазы в сыворотке крови и моче у лиц с разной степенью некроза паренхимы поджелудочной железы показали, что активность фермента в биологических жидкостях не отражает степень воспаления железы и их измерение имеет малое значение для наблюдения за состоянием больного. Тем не менее чувствительность и специфичность определения α-амилазы при диагностике острого панкреатита возрастают при изменении границ нормальных значений (дискриминационный уровень нормы и патологии – активность, в 1,5-2 раза превышающая верхние границы нормы). В этом случае определение активности α-амилазы наиболее информативно в первые сутки развития острого панкреатита [15]. По мнению ряда авторов, определение активности α-амилазы в сыворотке крови при хроническом панкреатите не имеет диагностического значения. Возможно, этот вывод сделан на ос­новании неудовлетворительной точности и воспроизводимости методов определения активности α-амилазы при низких (часто субнормальных) значениях активности фермента, характерных для данного заболевания.

У человека α-амилазу, свободно проходящую через фильтрационный барьер почечных телец, реабсорбируют клетки эпителия почечных канальцев так же, как и другие низкомолекулярные белки сыворотки крови. Увеличение активности амилазы в сыворотке крови может быть вызвано нарушением элиминации фермента. Пример – состояние, называемое макроамилаземией, когда фермент связан с иммуноглобулинами сыворотки крови и образует макромолекулярный комплекс [18]. Такой комплекс не фильтруется в мочу и не может быть удален при помощи каких-то иных механизмов, что ведет к значительному и порой длительному увеличению активности α-амилазы| в сыворотке крови. Макроамилаземия встречается у здоровых людей с частотой 1%, у лиц с гиперамилаземией – с частотой 2,5%. Макроамилаземия может быть диагностирована методом ультрацентрифугирования, ЭФ, гель-хроматографии, предложен также простой тест преципитации комплекса полиэтиленгликолем [8].

Активность α-амилазы в сыворотке крови часто увеличена при почечной недостаточности, однако не совсем ясно, что является причиной такого увеличения – возрастание образования фермента или снижение его элиминации. В таких случаях дополнительную информацию может дать определение скорости экскреции α-амилазы или расчет клиренса фермента.

По данным многих авторов, наиболее чувствительным и специфичным тестом для диагностики панкреатита служит уровень активности П-изофермента α-амилазы. Особое значение этот тест приобретает, если у больного с предполагаемым диагнозом панкреатита обнаружена нормальная общая активность амилазы. По сниженной активности П-амилазы может быть диагностирован хронический панкреатит. Доля П-изоамилаз в общей активности α-амилазы значительно выше в моче, чем в сыворотке крови, возможно, вследствие различий в экскреции изоферментов почками. Тем не менее диагностическое значение определения активности изоферментов α-амилазы в моче уступает таковому в крови [6, 10].

 

1.4 Методы определения активности амилазы

1.4.1 Амилокластические методы

 

Измерение активности α-амилазы для диагностических целей широко применяют в клинике на протяжении более 100 лет. За это время описано более 200 методов определения активности фермента. Несмотря на большое разнообразие предложенных методов, они могут быть объединены в 3 группы: амилокластитческие, глюкокластические и хромогенные [8].

Трудности при использовании крахмала в качестве субстрата связаны с тем, что образцы крахмала значительно отличаются по многим параметрам, в частности по соотношению амилозы и амилопектина. Длина цепи молекулы крахмала зависит от способа его получения и метода приготовления раствора субстрата. Крахмал нерастворим в воде. При приготовлении субстрата он образует коллоидный раствор, содержащий гидратированные мицеллы различного размера. Степень дисперсности меняется в зависимости от температуры; при более низких температурах образуются более крупные мицеллы. Наиболее часто используют картофельный и кукурузный крахмал. Некоторые авторы предпочитают в качестве субстрата для амилазы использовать амилозу, амилопектин, гликоген [1-3].

В амилокластических методах определения активности α-амилазы измеряют распад крахмального субстрата, используя турбодиметрический, йодометрический или нефелометрический принцип.

Йодометрические методы основаны на способности избытка негидролизованного субстрата давать в реакции с йодом окрашенные соединения. Интенсивность окраски зависит от состава субстрата: молекулы декстринов, имеющие более 30 гексозных остатков, дают красную окраску; молекулы, состоящие из 4-5 гексозных остатков, окрашенных продуктов в реакции с йодом не дают. Зависимость окраски от свойств и состава крахмального субстрата стоит вопрос о его унификации. Активность фермента определяют по убыли оптической плотности субстрата после гидролиза амилазой [8].

Нормальные величины активности α-амилазы, определенные методом Каравея, составляют: в сыворотке крови 3,3-8,9 мг/(с*л), или 12-32 мг/(ч*мл), в моче до 44 мг/(с*л), или до 120 мг/(ч*мл), в дуоденальном содержимом   1,7-4,4 г/(с*л), или 6-16 г/(ч*мл) [16].

Амилокластический метод определения активности α-амилазы по Смиту-Роу основан на фотометрическом измерении уменьшения концентрации растворимого крахмала в результате его гидролиза амилазой. Нормальные величины активности α-амилазы, определенной по методу Смита-Роу, составляют в крови – 16-30 мг, в моче – до 160 мг крахмала, гидролизованного амилазой, содержащейся в 1 мл крови или мочи, за 1 ч инкубации при 37° [15].

Амилокластические методы обладают рядом недостатков: в качестве субстрата в них применяется крахмал, соотношение амилозы и амилопектина в котором меняется от партии к партии. Поскольку эти субстраты гидролизуются с различной скоростью, результаты определения активности α-амилазы, в том числе в области нормальных значений, варьируют в зависимости от партии крахмала [1].

Интенсивность окраски йодом в значительной степени зависит от температуры. Это требует строгого поддержания  постоянной и одинаковой температуры в опытной и контрольных пробах.

При анализе наблюдается интерференция с альбумином и другими белками сыворотки крови.

Метод имеет узкую линейную область определения (до 80 г/л*час, при норме до 30 г/л*час). Поэтому при анализе необходимо использовать множественные разведения, что приводит к большому коэффициенту вариации (>10%).

Турбидиметрические методы основаны на способности амилазы снижать мутность суспензии субстрата в результате ферментативной деградации молекулы субстрата. Использование лазерной нефелометрии привело к повышению аналитической чувствительности и точности по сравнению с обычными нефелометрами. Турбидиметрические и светорассеивающие методы выполняют путем непрерывной регистрации или фиксированного времени. Эти методы сложно стандартизировать из-за различий в свойствах субстрата [2-5].

 

1.4.2 Глюкокластические методы

 

В последнее время получили распространение сахарогенные методы определения активности α-амилазы (Схема 1.1), основанные на ферментативном определении продукта реакции (глюкозы). Субстрат и ферменты, способствующие образованию глюкозы, различаются в коммерческих наборах разных фирм. Широкое применение получили методы с использованием УФ-спектроскопии [8]. В этих методах образование сахаров сопряжено с восстановлением НАД, и активность α-амилазы определяют по скорости увеличения абсорбции при длине волны 340 нм, обусловленной формированием НАДН. Ферментативные методы определения активности   α-амилазы особенно удобны при удобны при наличии автоматического автоанализатора, они позволяют использовать микроколичества (2-5 мкл) биологического материала, просты в исполнении. Однако они не лишены недостатков, обусловленных составом субстрата и комплексом сопряженных реакций; промежуточные продукты могут исказить конечный результат [16, 17].

 

 

 

Схема 1.1 Колориметрический сахарогенный метод

 

Интенсивность окраски продукта реакции пропорциональна активности фермента.

Сахарогенные методы также недостаточно точны, имеют узкую линейную область определения (до 3-4 верхних границ нормы) и высокий коэффициент вариации. Кроме того, при их применении часто необходимы предварительная депротеинизация сыворотки, а также нагревание реакционной смеси до 100 °С для развития окраски [1].

 

1.4.3 Хромогенные методы

 

Группа методов определения активности α-амилазы основана на использовании хромогенных нерастворимых субстратов. Хромогенный субстрат – полисахарид, длиной от 3 до 7 звеньев, который вследствие ковалентного связывания с красителем становится нерастворимым [8]. В результате реакции освобождается водорастворимый краситель, оптическую плотность которого измеряют. Методы различаются как субстратом (крахмал, амилопектин, амилоза, мальтоза), так и связанным с ним красителем. α-амилаза гидролизует субстрат с образованием растворимого хромогена. После остановки реакции непрореагировавший нерастворимый субстрат удаляют центрифугированием, и в супернатанте определяют оптическую плотность хромогена; для лучшей воспроизводимости желательно провести фильтрование супернатанта. Активность фермента рассчитывают по срав­нению со стандартом (препаратом α-амилазы) или контрольной сывороткой с известной активностью фермента, учитывая спонтанный гидролиз хромогенного субстрата. Единицу активности α-амилазы в этой группе методов рассчитывают по коэффициенту экстинкции хромогена [9-11].

Зарубежные фирмы выпускают преимущественно наборы, основанные на хромогенных методах. Данные наборы обладают хорошими аналитическими характеристиками, в том числе широкой областью определения (от 7 до 20 верхних границ нормальной концентрации для сыворотки крови), однако чрезвычайно дороги (до 200-300 $ за 100 мл рабочего реагента) и требуют дорогостоящего импортного оборудования (автоматических и полуавтоматических биохимических анализаторов). Это делает их практически недоступными для большинства клинических лабораторий России, Украины и стран-соседей [15, 16].

Хромогенные методы различают по виду субстрата: методы, использующие субстраты с определенной структурой и методы, использующие в качестве субстратов 4-нитрофенил-гликозиды.

В первой группе методов Используют субстраты амилазы с определенной структурой, а также вспомогательные и индикаторные ферменты, улучшающие стехиометрию реакции, что приводит к контролируемым условиям гидролиза субстрата при определении активности амилазы [1].

Оказалось, что гидролиз амилазой небольших по размерам олигосахаридов приводит к появлению продуктов реакции с более определенной структурой по сравнению с продуктами гидролиза крахмала. Из многих олигосахаридов наиболее удобными субстратами для определения активности α-амилазы оказались мальтопентоза и мальтотетроза, в связи с их высокой стабильностью, постоянными продуктами гидролиза и однозначной стехиометрией реакции [16, 19].

Еще одна группа субстратов для определения активности амилазы представляет собой небольшие олигосахариды (от 4 до 7 единиц глюкозы) с 4-НФ группой, присоединенной ковалентно к редуцирующему концу олигосахарида.

Использование ферментативных методов (с участием вспомогательных и индикаторных ферментов) становится возможным после добавления в инкубационную среду фермента α-гликозидазы (КФ 3.2.1.20; мальтаза) для гидролиза ди- и трисахаридов, образующихся под действием амилазы, до глюкозы [21]. Содержание глюкозы в среде определяли с использованием глюкозооксидазы (КФ 1.1.3.4) или pO2-электрода. Последнее позволяет использовать скорость потребления кислорода для характеристики активности амилазы в исследуемом образце (Схема 1.2):

 

 

 

Схема 1.2 Использование ферментативных методов для определения активности амилазы

 

Альтернативный метод использует тот же принцип, но требует введения в инкубационную среду фермента пероксидазы (КФ 1.11.1.7) для обеспечения индикаторной реакции окисления хромогена, например ABTS (2’,2’-azine-di-(3-ethylbenzthiazoline)-6-sulfonic acid), обладающего максимумом поглощения при 410 нм [20, 21]. Перекись водорода, образующаяся при окислении глюкозы, попадающей в инкубационную среду вместе с исследуемым материалом, разрушается каталазой (КФ 1.11.1.6); в конце преинкубационного периода активность каталазы блокируется, и индикаторная реакция протекает при участии перекиси водорода, образующейся при гидролизе субстрата (Схема 1.3):

 

 

 

Схема 1.3 Определение активности амилазы с использованием фермента пероксидазы

 

В подобранных условиях увеличение поглощения при 410 нм пропорционально активности амилазы исследуемого образца. Оба метода требуют 10-минутного преинкубационного периода для разрушения эндогенной глюкозы и завершения lag-фазы сопряженных реакций.

Предложены модификации данной последовательности реакций. Например, определение глюкозы может быть осуществлено с использование гексокиназы (КФ 2.7.1.1). Кроме того, образование мальтозы в инкубационной среде может быть обнаружено с помощью фосфорилазы мальтозы (КФ 2.4.1.8), что позволяет избежать влияния глюкозы исследуемого образца на результат определения амилазы в методе Beckman DS Amylase assay (Схема 1.4):

 

 

 

Схема 1.4 Определение активности амилазы с ферментами иного типа

 

Глюкоза, попадающая в среду инкубации с исследуемым образцом, не сказывается на активности амилазы, т. к. ее удаляют гель-фильтрацией на этапе подготовки материала для исследования. Гидролиз мальтопентозы приводит к высвобождению 5 молекул глюкозы и образованию соответствующих количеств молекулы НАДН2. Для данного метода характерна значительная скорость реакции в контроле из-за присутствия в изучаемом материале короткоцепочечных олигосахаридов, не удаляемых гель-фильтрацией, кроме того, реакция как в контроле, так и в опыте не подчиняется кинетике нулевого порядка. Не смотря на это, метод обеспечивает воспроизводимые результаты при использовании анализатора Du Pont [22-24].

При использовании короткоцепочечных олигосахаридов в качестве субстрата требуется сложная вспомогательная и индикаторная система ферментов для определения продуктов реакции, высвобождающихся под действием амилаз (Схема 1.5)

 

 

 

Схема 1.5  Индикаторная система ферментов для определения продуктов реакции

 

Как следует из представленной схемы, при гидролизе амилазой гликозидной связи в молекуле мальтотетрозы в конечном итоге образуются 2 молекулы НАДН2. Это соотношение справедливо только тогда, когда под действием амилазы в инкубационной среде не образуются ни глюкоза, ни мальтоза [1-3]. Оказалось, что оба продукта могут накапливаться в среде инкубации в значительных количествах, что приводит к занижению активности амилазы. Глюкоза, содержащаяся в исследуемом образце, не мешает определению амилазы. В то же время присутствие ЛДГ и пировиноградной кислоты в исследуемом образце сказывается на активности амилазы, т. к. ЛДГ в присутствии пирувата образца конкурирует за НАДН2, образованный в реакции, катализируемой Г-6-Ф-дегидрогеназой. Степень снижения НАДН2 зависит от активности ЛДГ, концентрации пирувата и активности амилазы образца [19, 23].

Многие из перечисленных методов представляют исторический интерес и оказались практически полностью вытеснены методами с короткими гликозидными цепями в качестве субстрата.

Использование таких субстратов и вспомогательных индикаторных ферментных реакций при определении активности АМИ улучшило стехиометрию реакции и привело к более контролируемым условиям гидролиза [1, 21-23].

Другим подходом оказалось использование субстратов в виде небольших олигосахаридов с 4-нитрофенильными группами (4-НФ) в качестве репортерных групп.

Во второй группе методов субстраты синтезируют путем присоединения 4-НФ к редуцирующему концу определенного олигогликозида. Если олигосахарид — мальтогептоза (Г7), то субстрат –      4-НФ-Г7. Амилаза расщепляет данный субстрат с образованием свободных олигосахаридов (Г5, Г4, Г3) и 4-НФ-Г2 (9%), 4-НФ-Г3 (31%) и 4-НФ-Г4 (60%) [20, 24]. Примечательно, что в значительных количествах не образуются Г6, Г1, 4-НФ-Г6 и 4-НФ-Г5. При добавлении a-глюкозидазы происходит гидролиз 4-НФ-Г4 до 4-НФ и олигосахарида; 4-НФ-Г3 и 4-НФ-Г2 гидролизуются до свободного 4-НФ и глюкозы.

Панкреатический изофермент гидролизует субстрат с большей скоростью, чем слюнный изофермент, в соотношении 1,8 : 1.

Совместное действие амилазы и α-глюкозидазы на субстрат приводит к тому, что более 30% продуктов реакции составляет свободный НФ. Свободный НФ обнаруживают по поглощению при 405 нм. Фермент             α-глиюкозидаза не действует на олигосахариды, содержащие больше 4 молекул глюкозы в цепи; Г4 гидролизуется чрезвычайно медленно        (Схема 1.6).

 

 

 

Схема 1.6 Совместное действие α-амилазы и α-глюкозидазы

 

В методе, разработанном в свое время компанией Boechringer Mannheim, в качестве субстрата амилазы использовали 4-НФ-Г7 и                 α-глюкозидазу. Определение сводится к преинкубации реакционной среды в кювете спектрофотометра в течение нескольких минут, добавлению 50 или 100 мкл образца и регистрации изменения поглощения при длине волны     405 нм. Изменение поглощения ΔЕ/мин пропорционально активности амилазы в исследуемом образце [21, 23]

В других методах используют смесь 4-НФ-Г5 и 4-НФ-Г6 в качестве субстрата амилазы. В присутствии a-глюкозидазы эти субстраты гидролизуются с высвобождением 4-НФ и 4-НФ-гликозидов с короткой цепью. Примером может служить метод Pantrak фирмы Calbiochem-Behring (San Diego, CA). Метод близок к приведенному выше [22].

При использовании 4-НФ-гликозидов исследователи столкнулись с двумя проблемами: низкой стабильностью субстрата в реакционной среде и неспособностью 4-НФ выступать в качестве эффективного индикатора активности амилазы.

Низкая стабильность реакционной смеси обусловлена медленным гидролизом 4-НФ-гликозидов α-глюкозидазой; этот эффект может быть ослаблен ковалентным связыванием «блокирующих» групп — либо 4,6-этилиден (этилиден-защищенный субстрат — EPS) [23], либо 3-кетобутилиден — с нередуцирующми концом молекулы. «Блокированный» субстрат обеспечивает более выгодные условия гидролиза: а именно, этилиден-4-НФ-Г7 как субстрат фрагментируется на 4-НФ-Г2 (40%), 4-НФ-Г3 (40%) и 4-НФ-Г4 (20%).

В результате увеличивается высвобождение 4-НФ; в то же время пропорционально уменьшается скорость реакции, так что эти эффекты компенсируют друг друга.

В настоящее время налажен выпуск рекомбинантной α-глюкозидазы (рекомбинантный фермент AGH-211 — Toyobo Co., Япония), способный полностью гидролизовать нитрофенилированные субстраты. В результате расщепления одной α-гликозидной связи при участии АМИ высвобождается одна молекула 4-НФ [1, 20].

Эксперты IFCC оптимизировали данный метод при 37° С и предложили его в качестве референтного

 

 

 

Рис. 1.2. Образование n-нитрофенола под действием α-амилазы и α-глюкозидазы из 4,6-этилиден-Г7-1-4-нитрофенил-(Г1)- α-D-мальтогептазида

 

Был предложен метод, основанный на использовании 2-хлор-п-нитрофенола (CNP) в составе субстрата 2-хлор-п-нитрофенил- α-D-мальтотриозида (CNP-G3) в реакции (Схема 1.7)

 

 

 

Схема 1.7 «Прямой» метод определения амилазы

 

Данный метод не требует дополнительного фермента α-глюкозидазы и относится к группе так называемых «прямых» методов [24].

Его недостатки связывали с низкой скоростью расщепления субстрата по сравнению с методами, основанными на использовании G4, G5 и G7; колебания величины молярного поглощения CNP связали с изменениями pH, температуры и содержания белка и присутствием активатора — тиоцианата калия, приводящего к аллостерическим изменениям амилазы [24].

Турбидиметрические методы недостаточно точны и чувствительны. Йодометрические (амилокластические) методы недороги, просты, быстры и чувствительны, но ограничены особенностями взаимодействия йод–белок, требуют контроля и трудно сопоставимы из-за различий в субстрате. Тем не менее они продолжают использоваться в виде готовых тест-систем и подходят для скринирущего метода. Американская ассоциация клинической химии (AACC) выбрала йодометрический метод для скрининга амилазы.

Традиционные сахарогенные методы относятся к категории самых надежных, однако они трудоемки, в них имеется высокий контроль и различные субстраты. Методы с сопряженными ферментативными реакциями и непрерывной регистрацией оказываются полезными, поскольку реакция может быть проведена без контроля. Это позволяет использовать их в автоматизированном режиме. При этом следует учитывать количество глюкозы в исходном образце [5-7, 8-11]. Это можно сделать, либо проводя анализ в 2 этапа, что позволит глюкозе образца реагировать вначале, либо использовать контроль на образец сыворотки. Такие контроли могут быть очень высоки, затрудняя спектрофотометрию. В целом эти реакции сложны и достаточно дороги. Они редко подчиняются истинной нулевой кинетике.

Хромогенные методы могут быть быстрыми, точными и легкими в исполнении, но часто включают ручные этапы, которые затрудняют автоматизацию.

Методы, использующие п-нитрофенил-замещенные субстраты с определенной структурой, являются исключением, поскольку легко автоматизируются. Величина молярного поглощения п-нитрофенола около 19 000 л х моль-1 * см-1, эти методы более чувствительны по сравнению с сахарогенными методами, поскольку высвобождение глюкозы мониторируется реакцией гексокиназа–НАД, с величиной молярного поглощения НАДН2 6220 л * моль-1 * см-1 [1, 3-8].

Субстрат п-нитрофенилгептаозид одинаково активен и со слюнным, и с панкреатическим изоферментом. Результаты хорошо коррелируют с сахарогенным методом с сочетанными ферментативными реакциями на глюкозу. На эти методы не влияют гемоглобин, липемия или глюкоза [5, 8].

 

1.5 Расчеты ферментативной активности

 

Активность фермента численно равна скорости ферментативной реакции в оптимальных условиях на начальном линейном участке кинетической кривой (рис. 1.3).

 

 

 

Рисунок 1.3 Кинетическая кривая ферментативной реакции, подчиняющаяся уравнению Михаэлиса-Ментена:

a – субстрат (нисходящая кинетика); б – продукт (восходящая кинетика).

 

Концентрация субстрата при этом должна в 5–10 раз превышать КМ для данной реакции. Очевидно, что все факторы, влияющие на скорость ферментативной реакции, влияют и на активность фермента.

Каталитическую активность ферментов выражают в единицах активности. Чаще всего в лабораторной практике используют международные единицы активности [16, 19].

Международная единица активности (МЕ, U, Е, Ед) – это количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата или получение 1 мкмоля продукта в минуту в стандартных оптимальных условиях [4].

Единица активности в системе СИ – катал (кат.). Она соответствует количеству фермента, которое катализирует превращение 1 моля субстрата или получение 1 моля продукта в секунду.

1 кат. = 6 * 107 МЕ.

1 МЕ = 16, 67 * 10–9 кат.

В медицине концентрацию ферментов в биологических жидкостях принято выражать в единицах активности на литр (МЕ/л, кат./л). Иногда используют другие (немеждународные) единицы активности. Это целесообразно, например, в тех случаях, когда субстрат и продукт, по которому определяют активность, представляет собой смесь полимерных молекул различной длины и его концентрацию нельзя выразить в мкмоль/л. В этом случае ее выражают, например, в г/л или мг/л. Так, при определении активности α-амилазы методом Каравея в качестве субстрата используют крахмал, который представляет собой смесь полисахаридов различной длины, соответственно, активность измеряют в г/(л*ч) или в мг/(л *с) [5-7].

Ферментативную активность рассчитывают по калибратору, калибровочной кривой и коэффициенту экстинкции продукта или кофермента.

1. Расчет по калибратору (стандарту) проводят, если можно приготовить стабильный дешевый калибратор и включить его в состав набора. Как правило, им является раствор продукта реакции известной концентрации. При этом на всей области определения активности фермента оптическая плотность реакционной смеси должна линейно зависеть от концентрации продукта (субстрата), т. е. подчиняться закону Бугера-Ламберта-Бера. Расчет по калибратору используют, например, при определении активности a-амилазы сахарогенным методом [15-18].

2. Расчет по калибровочной кривой проводят, если оптическая плотность реакционной смеси нелинейно зависит от концентрации продукта реакции

Это может происходить по ряду причин: поток световой энергии не является монохроматическим, что имеет место, когда используют интерференционные и стеклянные светофильтры, т. е. зависит от средств измерения оптической плотности; молекулы растворителя взаимодействуют с частицами вещества, поглощающими световую энергию, это взаимодействие изменяется с изменением концентрации вещества; изменение рН раствора влияет на устойчивость образующихся соединений; прочее.

При нелинейной зависимости оптической плотности реакционной смеси от концентрации продукта реакции в процессе анализа одновременно с опытными пробами инкубируют не менее четырех стандартных проб, содержащих продукт в различных, но известных концентрациях. По полученным данным строят калибровочный график в координатах {X = E}, {Y = ∆A/мин} (или Y = ∆A/за время реакции, ∆A = Аоп – Ахол) и по нему находят активность фермента в опытной пробе [6-9, 17-19]. Этот способ используют, например, в методе для определения активности α-амилазы на основе нерастворимого крахмала (см. рис. 12, б), в методе Райтмана-Френкеля при определении трансаминаз или g-ГТ методом «по конечной точке».

3. Расчет по коэффициенту экстинкции продукта или кофермента проводят, если эти вещества обладают оптической плотностью и их прямое фотометрирование можно осуществить в процессе анализа, а оптическая плотность реакционной смеси линейно зависит от концентрации продукта или кофермента [2, 14]. Для расчета используют формулу Бугера-Ламберта-Бера (рис. 1.4).

 

,           (1.1)

 

где

Е – активность фермента, Е/л;

∆A/мин – изменение оптической плотности реакционной смеси за 1 мин, ед. опт. плотности/мин;

V – объем реакционной смеси, мл;

ε – миллимолярный коэффициен экстинкции, л/ммоль  ×  см;

l – длина оптического пути, см;

v – объем пробы (сыворотки), мл;

1000 – коэффициент пересчета активности в мкмоль/(мин Ч л).

 

Для удобства вычислений можно самим заранее рассчитать дробь в этой формуле, ее обозначают F и называют фактором.

 

 

 

Рисунок 1.4 Калибровочная кривая:

а – при отклонении от закона Бугера-Ламберта-Бера; б – при определении активности α-амилазы с нерастворимым крахмалом (время инкубации 15 мин).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 Аппаратура и материалы

2.1.1 Приборы

 

1. Фотометрическое оборудование (ФЭК) для измерения оптической плотности растворов при длине волны 640 (600–700) нм в диапазоне (0–1.0) ед. оптической плотности и длине оптического пути 10 мм.

2. Водный термостат или баня, обеспечивающая инкубацию пробирок при температуре (37±1) ºС

 

2.1.2 Посуда

 

Для приготовления рабочих растворов использовались мерная колба 1000 мл, конические колбы на 50, 100 и 200 мл; пробирки вместимостью 10 мл, бюксы; пипетки с делениями вместимостью 0.1 и 5 мл.

 

2.1.3 Реактивы

 

Буферный раствор двузамещенного фосфатного буфера;              рН (4.7±0.2)

Раствор субстрата (крахмал растворимый, свежеприготовленный);

Биологическая жидкость, свежеприготовленная (сыворотка, плазма крови, моча);

Раствор йода с йодидом калия (свежеприготовленный).

 

 

 

 

 

2.2 Методики приготовления растворов и измерения

 

Образцы биологических жидкостей следует отбирать согласно стандартной методике, принятой при выполнении лабораторных тестов. Рекомендуется использовать свежеотобранные образцы сыворотки или плазмы крови. Также допускается тестирование свежеотобранных образцов мочи.

Не рекомендуется использовать для анализа цельную кровь.

Пробирки с кровью всегда держите закрытыми и в вертикальном положении. Сыворотку и плазму необходимо тщательно отделить от клеточных элементов крови, желательно не позднее, чем через два часа после отбора проб.

Отделенную от клеток сыворотку или плазмуможно хранить при комнатной  температуре не более восьми часов. Если анализы не завершены за 8 часов, образцы должны храниться при температуре от +2°C до +8°C. Если анализы не были завершены в течение 48 часов или есть необходимость хранить образцы дольше, то их следует заморозить до температуры от –15°C до –20°C. Размораживать образцы можно только один раз. Повторное замораживание/размораживание образцов делает их непригодными для анализа.

Образцы мочи рекомендуется протестировать в течение двух часов после отбора. Контейнер с образцами мочи, собранной за определенный период времени, следует хранить в течение всего периода отбора в холодильнике или на льду. Использование консервантов не требуется.

Раствор крахмала с массовой долей 1 %. Навеску растворимого картофельного крахмала массой 1,00±0,01 г помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, приливают 25 мл дистиллированной воды и перемешивают. Затем добавляют еще 25 мл дистиллированной воды, помещают колбу в кипящую водяную баню и выдерживают при помешивании до полного растворения крахмала. Содержимое колбы охлаждают до 20ºС, добавляют 10 мл раствора фосфатного буфера с рН 4,7–4,9. Объем доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.

Полученный субстрат после реакции с раствором йода должен иметь оптическую плотность 0,70. Для проверки этого 10 мл субстрата наливают в пробирку, добавляют 5 мл дистиллированной воды и перемешивают. Затем 0,5 мл этого раствора переносят в коническую колбу с предварительно налитыми 50 мл рабочего раствора йода. Полученный окрашенный раствор колориметрируют на КФК-2 или КФК-3 в сравнении с дистиллированной водой в кювете с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм при светофильтре с длиной световой волны 650 нм.

Раствор субстрата можно хранить в течение 10 дней в холодильнике. Перед каждым использованием субстрат следует нагревать в кипящей водяной бане в течение 5-10 мин, а затем охлаждать.

Основной раствор йода. Навеску кристаллического йода массой     ±0,01 г и йодида калия массой 5,00±0,01 г растворяют в 5–7 мл дистиллированной воды в бюксе при перемешивании стеклянной палочкой. После растворения смесь количественно переносят в мерную колбу вместимостью 200 мл, доводят до метки объем колбы дистиллированной водой при 20°С и перемешивают. Основной раствор хранят в темном месте в течение 1 мес.

Рабочий раствор йода. Готовят из основного раствора: 2 мл основного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем до метки раствором соляной кислоты концентрации 0,1 моль/ л.

Перед употреблением проверяют оптическую плотность рабочего раствора в кювете с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм при светофильтрах с длиной волны 450 нм. Оптическая плотность должна быть 0,220±0,010. Корректировку проводят обычным методом.

Ход определения: 5 мл субстратно-буферного раствора помещают в колбу, емкостью 50 мл, нагревают 5 мин. при 37 ºС, добавляют 0,1 мл биологической жидкости: сыворотки, профильтрованной мочи или дуоденального содержимого (предварительно разведенного 0,85%-раствором хлористого натрия в 100 раз). Инкубируют 7.5 минут при 37 ºС. Время инкубации следует строго отсчитывать по секундомеру с момента добавления биологической жидкости в крахмальный субстрат. Тотчас же после инкубации добавляют 5 мл рабочего раствора йода и доводят объем дистиллированной водой до 50 мл [14, 15]. Измеряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 630–690 нм (красный светофильтр) против воды. Холостую пробу ставят как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации, вместе с рабочим раствором йода. Измеряют при тех же условиях, что и опытную пробу, против воды.

Ультрамикровариант. Ход определения опытной и  холостой  пробы тот же, что и при микроварианте, но объем всех реактивов иисследуемой биологической жидкости уменьшают в 5 раз. Определение проводят в пробирках, калиброванных на 10 мл [14].

 

Активность α-амилазы выражают в мг крахмала, гидролизованного 1 мл биологической жидкости за 1 час инкубации при 37 ºС. Расчет производят по формуле:

1) Активность α-амилазы, мг/(ч*мл):

 

(2.1)

 

где

Ехолост. и Еисслед. – оптические плотности холостой и исследуемой пробы соответственно;

а – количество крахмала, введенного в опытную и холостую пробы, мг;

в – коэффициент пересчета на 1 час инкубации;

с – коэффициент пересчета на 1 мл биологической жидкости;

К – коэффициент разведения образца.

При активности фермента выше 140 мг биологическую жидкость следует развести 0.85%-ным раствором хлористого натрия и коэффициент разведения учитывать при расчете активности фермента [14, 16].

Нормальные границы активности фермента при 37 ºС:

Сыворотка крови – 12-32 мг крахмала/(мл*час).

Моча – 20-160 мг крахмала/(мл*час).

Дуоденальное содержимое – 6-16 г крахмала/(мл*час).

Примечания.

1. Гемолиз не влияет на активность фермента.

2. Для определения активности амилазы рекомендуется исследовать свежую биологическую жидкость.

3. Серия исследований должны быть не больше, чем 5-7 проб.

4. Активность α-амилазы зависит от температуры. Анализ, который выполняется при температуре меньше + 37 ºС или больше 37 ºС, показывает соответствующие уменьшение или увеличение активности.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3. Результаты и обсуждения

3.1 Проблемы, связанные с определением активности амилазы

 

Несмотря на пристальное внимание, уделяемое изучению α-амилазы на протяжении многих лет, исследование активности фермента сопряжено с отдельными трудностями: отсутствием гомогенного субстрата с определенной химической структурой, образованием смеси продуктов реакции, множественными механизмами реакции. В настоящее время в клинической биохимии это единственный фермент, для которого не разработан не только референсный, но даже оптимальный метод определения активности, малодоступен стабильный материал для проведения внешнего контроля качества. Отсутствие унифицированного субстрата, разные механизмы реакции и образуемые продукты реакции – все это находит отражение во множестве способов выражения активности фермента (амилокластические единицы, хромогенные и др.), что затрудняет сопоставление данных, полученных разными методами.

Различие в механизме и продуктах реакции, способе выражения активности фермента ставит вопрос о сопоставимости данных, полученных разными методами. В ряде работ установлено, что результаты определения активности α-амилазы хорошо коррелировали друг с другом, однако значения активности фермента, определенные каждым из методов, были различными. В этой связи высказано сомнение в идентичности данных, полученных в реакциях с разными механизмами действия.

Среди обычно используемых методов разделения изоферментов          α-амилазы следует отметить ЭФ на разных поддерживающих средах, хроматографию, изоэлектрическое фокусирование, определение активности с учетом специфичности по субстратам и ингибиторам каждого из изоферментов, иммунохимические методы. [8].

α-Амилаза – стабильный фермент, активность которого не изменяется при хранении при 20 °С в течение недели и при 4 °С в течение месяца. Хранение проб сыворотки крови при –20 °С в течение 3 месяцев при неоднократных замораживаниях и оттаиваниях не изменяет спектр изоферментов. Изменения истинного распределения фракций амилазы могут происходить, если процедуру ЭФ проводят при 37 °С в течение нескольких часов. Нежелательна также длительная инкубация при 37 °С при определении низкой активности фермента [8, 9].

Особые проблемы связаны с хранением проб мочи. Известно, что амилаза быстро инактивируется при рН ниже 5,0, поэтому рекомендовано собирать мочу в буфер при рН 7,0. Однако если моча находится в мочевом пузыре хотя бы некоторое время, фермент будет инактивирован кислой мочой. Сомнительно также, сможет ли фермент избежать распада в очень кислой моче, перед тем как покинет почки. Влияние мочи с низким рН на активность фермента необходимо учитывать при исследовании отношений клиренсов амилазы и креатинина, проводимом у больных с нарушенной функцией почек.

 

3.2 Влияние различных факторов на активность определения амилазы

 

Проведенные исследования  активности α-амилазы сыворотки крови в интервале температур от 10 до 70 ºC показали, что пр



Другие работы по теме: