Contribution to International Economy

  • Біосинтез антибіотиків бактеріями роду стрептоміцети (streptomyces)

ЗМІСТ

 

Вступ  3

1. Загальна характеристика (будова) 5

2. Антибіотики, що ними продукується  9

2.1. Протипухлинні 9

2.2. Антибактеріальні 11

2.3. Протигрибні 17

3. Механізми синтезу антибіотиків  19

Висновок  26

Список літератури  27

 


Вступ

Ускладнення епідеміологічної ситуації при умові зниження популяційного імунітету та відповідній соціально-економічній ситуації може виникнути будь в якій країні [2, c. 3.]. Тому цілком природно, що серед дослідників існує зростаючий інтерес до підвищення ефективності ліків, зокрема антибіотиків, та створення захисних композицій з активністю, які могли б покращити локальний захист організму проти збудників деяких інфекційних захворювань [3, c. 78]. Істотним стимулом для розробки нових антибіотиків є зростаюче використання їх y медицині.

Антибіотики - це антимікробні речовини, як правило, природного походження і продукти їх хімічної модифікації, що пригнічують в мізерно малих концентраціях ріст і розвиток найпростіших, мікроорганізмів, нижчих грибів, вірусiв і клітин злоякісних пухлин. До антимікробних засобів відносять антисептики, дезінфектанти і хіміотерапевтичні речовини.

Процес отримання антибіотика включає в себе чотири основні стадії: отримання відповідного штаму - продуцента антибіотика, придатного для промислового виробництва; біосинтез антибіотика; виділення і очищення антибіотика; концентрування, стабілізація антибіотика та отримання готового продукту [1, c. 112].

В даний час культивування штамів-продуцентів відкриває все нові можливості для отримання широкого кола біологічно активних сполук, в тому чiслi i антибіотиків. У зв'язку з цим перспективні біотехнологічні процеси, в яких для зростання ефективностi використовують стійкі штами продуценти. Зростаюча роль застосування антибіотиків у медицині висуває важливе завдання пошуку зручних та економічних продуцентів [4, c. 51].

Серед мікроорганізмів, що використовуються в промисловості, особливе місце займають ґрунтові бактерії роду Streptomyces, які є важливим джерелом багатьох вторинних метаболітів з широким діапазоном біологічної дії (вітаміни групи В, гетероауксини, гібереліни, імуномодулятори, антибіотики тощо) [Орлова Т.И. и др., 1999; Hobbs G. et al., 1992; Егоров Н.С., 1994]. Пошук нових біологічно активних речовин у стрептоміцетів залишається актуальним в сучасній біотехнології.

Рівень синтезу антибіотиків стрептоміцетами зумовлений не лише експресією генів синтезу, а в значній мірі залежить від резистентності продуцента як до власного, так і до інших антибіотиків [Громико О., 2000; Adamidis T., 1990; August P.R., 1996].

 


1. Загальна характеристика (будова)

Streptomyces — рід бактерій типу актинобактерії, тобто грам-позитивних бактерій з високим вмістом гуаніну/цитозину бактерії [7]. Streptomyces знаходяться в основному в ґрунті і у залишках рослин, більшіть видів формують ендоспори. Streptomycetes відомі своїм характерним «земляним» запахом, який походить від виробництва непостійного метаболіту, геозміну.

Streptomycetes характеризуються складним вторинним метаболізмом. Вони виробляють велике число антибіотиків, які знаходяться у клінічному використанні. Стрептоміцин, який зараз вже рідко використовується, бере свою назву безпосередньо від назви роду Streptomyces. Streptomyces інколи можуть бути патогенами людини, наприклад, нечаста інфекція міцетома може бути викликана S. somaliensis.

Послідовність геному одного з штамів, S. coelicolor A3(2), була секвентирована і опублікована в 2002 році [8]. На той час, він був найбільшим секвентированим бактеріальним геномом. Послідовність генома S. avermitilis була завершений в 2003 році [9]. Це була перша повна послідовність генома промислового мікроорганізму. Обидва з цих геномів охоплюють одну хромосома, лінійну, на відміну від більшості бактерійних геномів, які мають круглу хромосому. Послідовність генома Streptomyces scabies, члену ряду із здатністю викликати хворобу картоплі, також завершена і буде опублікована в 2007 році.

Стрептомицеты

Рис. 1 Streptomyces sp.

По числу спор актиноміцети ділять на моно- (наприклад, Saccaromonospora, Micromonospora) оліго- (Actinomadura) і полі спорові (Streptomyces), виділяючи особливо ті, які утворюють спорангії. Спороутворення переважно екзогенне (Thermoactinomyces утворює ендоспори, проте в даний час цей рід на підставі хемотаксономічних і генетичних ознак, не дивлячись на виражену міцеліальну стадію схильні відносити до бацил), рідше псевдоендогенні (Planomonospora, Dactylosporangium).

У Streptomyces спори утворюються в два етапи:

1. Апікальна ділянка повітряної гіфи відділяється септою, нуклеоїд витягується.

2. Майже одночасно клітина ділиться септами на ділянки, нуклеоїд ділиться в тих же місцях, клітинна стінка стає в 2 рази товща, спори округляються і їх стінка стає в 7 разів товща за стінку гіфи.

Актиноміцети (роду Streptomyces, Streptosporangium, Micromonospora, Actinomadura) є постійними мешканцями кишечнику дощових черв'яків, термітів і багатьох інших безхребетних. Руйнуючи целюлозу і інші біополімери, вони є їх симбіонтами. У організмі людини мешкають в ротовій порожнині, в кишечнику, в дихальних шляхах, на шкірі, в зубному нальоті, в каріозних зубах, на мигдалинах.

Геноми представників роду Streptomyces представлені лінійними молекулами ДНК. Хромосома Streptomyces coelicolor A3(2) є лінійною молекулою ДНК розміром 8667507 п.н., що містить 7825 гена, які кодують білки, відсоток Г+Ц пар складає 72,1 % [12]. Геном Streptomyces avermitilis також представлений лінійною молекулою ДНК розміром 9025608 п.н., що містить 7581 гена, які кодують білки, відсоток Г+Ц пар складає 70,7 % [12].

Лінійна хромосома Streptomyces scabies має розмір 10148695 п.н., відсоток Г+Ц пар складає 71,45 % [12]. Геном Streptomyces griseus штаму IFO 13350 має розмір 8545929 п.н., містить 7138 передбачених відкритих рамок прочитування, відсоток Г+Ц пар складає 72,2 % [12]. Іншою незвичайною особливістю геномів представників роду Streptomyces, окрім наявності великих лінійних хромосом, є наявність лінійних же довгих паліндромних плазмід [9], наприклад Streptomyces coelicolor A3(2) має два плазміди SCP1 і SCP2, що є лінійними молекулами ДНК розміром 356023 і 31317 п.н. відповідно, і які містять відповідно 449 і 40 генів [6].

Рід Streptomyces є найкрупнішим родом, що синтезує антибіотики і використовується з 1940—1950 р. в промисловому виробництві антибіотиків [12]. Зараз представники роду Streptomyces активно використовуються в генній інженерії як господарі для клонування і експресії чужорідної ДНК, оскільки в клітках Streptomyces відбувається коректна упаковка білків, білок потім секретуєтся в навколишнє середовище [13], на відміну від широко використовуваною для цієї мети Escherichia coli.

Біосинтез антибіотиків – складний багатоетапний ферментативний процес, який забезпечується роботою цілого комплексу специфічних генів [14]. В результаті детального дослідження генетичної детерміації біосинтезу антибіотиків у ряду мікроорганізмів-продуцентів встановлено, що комплекси структурних генів і оперонів, що беруть участь в цьому процесі, представляють собою кластери. Очевидно, як і у разі описаних у бактерій систем оперонного типу, кластерна організація сприяє експресії, регуляції і еволюції цих генів у складі генома організму-продуцента [15].

У складі вивчених кластерів генів біосинтезу антибіотиків виявлені:

а) структурні гени, що кодують ферменти, що беруть участь в біосинтезі відповідних антибіотиків;

б) ген стійкості, що забезпечує захист мікроорганізму-продуцента від утворюваного ним антибіотика;

Аналіз нуклеотидних послідовностей фрагментів ДНК кластерів генів біосинтезу антибіотиків у Streptomyces виявив високий ступінь подібності окремих генів і їх взаємного розташування в кластерах, що визначають синтез аналогічних, споріднених або схожих по структурі антибіотиків. Значні співпадання виявлені не тільки між кластерами генів біосинтезу споріднених антибіотиків у різних видів Streptomyces, але і між власними генетичними структурами синтезу аналогічних або споріднених антибіотиків стрептоміцетів і еволюційно віддалених від них організмів, наприклад, нижчих грибів [14]

На підставі даних літератури можна виділити три узагальнені схеми структурно-функціональної організації ділянок ініціації транскрипції кла-стеров генів біосинтезу антибіотиків (рис. 2) [16; 17; 18]. Схема 1 є відображенням початкового етапу розвитку уявлень про організацію механізму транскрипції кластерів генів біосинтезу антибіотиків. Схеми 2 і 3 характеризують кластер генів біосинтезу з штаму S. coelicolor. На думку В. Ю. Табакова і Т. А. Воейковой [14], кластери генів біосинтезу стрептоміцину з штаму S. griseus і біалафосу з штамів S. hydroscopicus і S. viridochromogenes володіють організацією, відповідній схемі 3.

 

Рис. 2. Три принципові схеми організації кластерів генів біосинтезу антибіотиків у Streptomyces [18]:

1 – схема дивергентної транскрипції генів резистентності і антибіотикоутворення;

2 – схема, що припускає участь гену-репресора, продукт якого здійснює негативний контроль транскрипції орієнтованого в протилежному напрямі гена резистентності;

3 – схема специфічної регуляції транскрипції генів стійкості;

ant – структурні гени біосинтезу антибіотиків;

res – ген стійкості до антибіотика, що синтезується;

rep – ген, що кодує репресор гена стійкості і/або генів біосинтезу;

reg – ген, що здійснює позитивну регуляцію транскриптонів кластеру


2. Антибіотики, що ними продукується

2.1. Протипухлинні

Даунорубіцин — хіміотерапічний агент класу антрациклінів, який використовується для лікування деяких типів раку, а також як стартовий матеріал для синтезу інших антрациклінів: доксорубіцину, епірубіцину, ідарубіцину та ін. Особливо часто використовується для лікування певних типів лейкемії (гостра мієлоїдна лейкемія і гостра лімфоциклічна лейкемія). Вперше був ізольований з мікроорганізмів Streptomyce peucetius.

Продукується мікроорганізмами Streptomyces coeruleorubidus або Streptomyces peucetius. Пригнічує зростання грам-позитивних бактерій і мікобактерій, але проявляє низьку активність по відношенню до грам-негативних бактерій. Застосовується в хіміотерапії раку і як стартовий матеріал у виробництві ряду інших антрациклінових антибіотиків (доксорубіцин, епірубіцин, ідарубіцин і ін.). Молекула даунорубіцина складається з тетрациклічеського антрахиноїдного аглікона даунорубіцинона, сполученого глікозідной зв'язком з аміноцукром даунозаміном. Синоніми: рубоміцин, рубідоміцин, дауноміцин.

По фізичних характеристиках даунорубіцин є порошком або пористою масою червоного кольору. Розчинимо у водних розчинах кислот, ацетоні, бутаноле. Комерційно доступний у вигляді даунорубіцина гидрохлоріда.

Даунорубіцина гидрохлорід є кристалічний порошок оранжево-червоного або червоного кольору, CAS-код 23541-50-6, брутто-формула C27H29NO10HCl, молекулярна маса 563,98, плавиться при 177 °C з розкладанням [10].

Доксорубіцин (синтезується бактеріями S. coeruleorubidus и S. peucetius) або гідроксилдаунорубіцил — лікарський препарат, що взаємодіє з ДНК і широко використовувається в хіміотерапії. Це— антрацикліновий антибіотик, що структурно нагадує дауноміцин і також інтеркалює в молекулу ДНК. Він використовується в лікуванні широкого ряду видів раку.

Протипухлинний антибіотик антрациклінового ряду. Механізм дії зумовлений взаємодією з ДНК, утворенням вільних радикалів і прямим впливам на мембрани клітин з пригніченням синтезу нуклеїнових кислот. Клітини чутливі до препарату в S- і G2-фазі.

Після внутрішньовенного введення концентрація доксорубіцину у плазмі крові швидко знижується, що зумовлено його розподіленням у тканинах організму. Доксорубіцин не проходить крізь гематоенцефалічний бар’єр. Нема доказів, що доксорубіцин проникає крізь плаценту, але він може завдати шкоди плоду.

Абсорбція препарату – висока, розподілення - рівномірне. Пресистемний метаболізм незначний. Обсяг розповсюдження - 25 л. Зв’язок з протеїном плазми - 74-76%. До 45 % препарату виводиться із сечею. З жовчю і калом протягом 7 діб виводиться до 50%.

Показання для застосування: Рак молочної залози, рак легенів, рак яєчників, рак сечового міхура, рак щитовидної залози, саркоми м’яких тканин, остеосаркома, лімфогранулематоз, неходжкінська лімфома, нейробластома, саркома Юінга, пухлина Вільямса, гострий лімфобластний лейкоз, гострий мієлобластний лейкоз.

Блеоміцин - протипухлинний засіб. Препарат є А2-фракцієювиділеною з культури Streptomyces verticіllus, що містить протипухлинний антибіотик. Механізм дії пов'язаний із здатністю спричиняти фрагментацію молекул ДНК. Має слабко виражену мієлодепресивну та імунодепресивну активність.Незначною мірою пригнічує кровотворення.

Період напіввиведення при кліренсі креатині ну більше 35 мл/хв. становить 115 хв. Блеоміцин має властивість накопичуватися (при парентеральному введенні) в шкірі, завдяки чому препаратособливо ефективний при раку шкіри і слизових оболонок. Виводиться нирками,60-70 % переважно у незміненому вигляді.

2.2. Антибактеріальні

Еритроміцин (продуцент S. erythreus). Бактеріостатичний антибіотик з групи макролідів, оборотно зв’язується з 50S субодиницею рибосом, що порушує утворення пептидного зв’язку між молекулами амінокислот та блокує синтез білків мікроорганізмів (не впливає на синтез нуклеїнових амінокислот). При застосуванні у великих дозах, залежно від виду збудника, може проявляти бактерицидну дію. Спектр дії включає грам- позитивні (Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Bacillus anthracis, Corinebacterium diphtheriae) та грамнегативні (Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Brucella spp., Legionella spp.) мікроорганізми, а також Mycoplasma spp., Chlamidia spp., treponema spp., Rickettsia spp.

При місцевому застосуванні у вагітних тварин проникає крізь плаценту, виявляється у плазмі крові у низьких концентраціях. Негативного впливу на плід не виявлено.

Застосовують зовнішньо. Мазь наносять на уражені місця 2–3 рази на день, при опіках – 2–3 рази на тиждень. Можливе застосування у дітей від народження. Тривалість лікування встановлюється індивідуально залежно від перебігу захворювання.

Неоміцин (продуцент S. fradiae). Комбінований препарат, який за допомогою компонентів, що входять до його складу, справляє протимікробну, протигрибкову, місцеву протизапальну дію. Гідрокортизон має протизапальний і протисвербіжний вплив. Зменшує запальні явища, свербіж, які супроводжують різні види дерматозів. Неоміцин є антибіотиком широкого спектра дії, активний щодо низки грампозитивних (стафілококів, ентерококів) і грамнегативних (Klebsiella spp., Proteus spp., Escherichia coli) бактерій. Натаміцин належить до полієнових антибіотиків групи макролідів, активний відносно дріжджових та дріжджоподібних грибів (у т.ч. Candida, Aspergillus), дерматофітів (серед них - Trichophyton, Microsporum), а також Trichomonas, Torulopsis, Fusarium.

Натаміцин і неоміцин практично не абсорбуються через ушкоджену шкіру та слизові оболонки. Можлива абсорбція неоміцину через ушкоджену шкіру, при потраплянні препарату на рани, виразки. Через неушкоджену шкіру абсорбується від 1 до 3% гідрокортизону; при екземі кількість гідрокортизону, що абсорбується, збільшується у 2 рази, при інфекційних ураженнях шкіри – у 5 разів. У дітей абсорбція гідрокортизону крізь неушкодженну шкіру вище, ніж у дорослих.

Стрептоміцин (продуцент S. griseus). Стрептоміцин має широкий спектр антимікробної (бактерицидної) дії. Він активний відносноMycobacterium tuberculosis, більшості грамнегативних: Escherichia coli,Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia spp., Klebsiella spp. (у т. ч. Klebsiella pneumoniae), Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Yersinia pestis, Francisella tularensis, Brucella spp. та деяких грампозитивних мікроорганізмів: Staphylococcus spp., Corynebacterium diphtheriae. Менш активний відносно Streptococcus spp. (у т. ч. Streptococcus pneumoniae), Enterobacter spp. Стрептоміцин неактивний відносно анаеробних бактерій, Spirochaetaceae, Rickettsia spp., Proteus spp., Pseudomonas aeroginosa.

Бактерицидну дію виявляє внаслідок зв'язування з 30S-субодиницейбактеріальної рибосоми, що в подальшому призводить до пригнічення синтезубілка.

Погановсмоктується зі шлунково-кишкового тракту та майже повністю виводитьсякишечником, застосовується тільки парентерально. Стрептоміцин привнутрішньом'язовому введенні швидко та повністю абсорбується в кров.Максимальна концентрація його в крові спостерігається через 1–2 години. Післяодноразового введення у середній терапевтичній дозі антибіотик визначається вкрові протягом 6–8 годин. Створюються високі концентрації препарату в легенях,нирках, печінці, позаклітинній рідині. Препарат має слабку тропність до жировоїта кісткової тканин. Через неушкоджений гемато-енцефалічний бар’єр не проникає.Добре проникає крізь плаценту та в грудне молоко. Препарат зв'язується збілками крові менше ніж на 10%. При нормальній видільній функції нирок приповторних введеннях не накопичується в організмі. Не метаболізується. Періоднапіввиведення становить 2–4 години. Екскретується переважно нирками (95%) унезмінному вигляді. Виведення препарату сповільнюється при порушеній функціїнирок, при цьому концентрація його в організмі підвищується та можутьрозвинутись побічні реакції (нейротоксичні).

Лікування вперше виявленого туберкульозу легень татуберкульозних уражень інших органів. Хворим, що лікувались раніше, препаратдоцільно призначати після лабораторного виявлення чутливості до нього виділениххворим мікобактерій. Також застосовують при гнійно-запальних процесахрізної локалізації, що спричинені грампозитивними та грамнегативнимимікроорганізмами, чутливими до препарату: при пневмонії, викликанійклебсіелами, при чумі і туляремії, при бруцельозі й ендокардиті.

Тетрациклін (продуцент S. rimosus)

Тетрациклін має широкий спектр антибактеріальної активності. Порушує утворення комплексу міжтранспортною РНК та рибосомою, що призводить до порушення синтезу білка мікробною клітиною. Активний відносно більшості грампозитивних таграмнегативних бактерій, cпipoxeт, лептоспор, рикетсій, збудників трахоми, орнітозу, крупних вipyciв. Малоактивний або неактивний відносно синьо гнійної палички, протея, більшості грибів, вipyciв грипу, кору, поліомієліту. Недостатньо активний відносно кислотостійких бактерій.

Після прийому внутрішньо всмоктується до 66 % прийнятої дози тетрацикліну. Зв’язується з білками на 65%. Добре проникає у piзнi органи та тканини, а також у біологічні рідини: жовч, синовіальну, асцитичну, цереброспінальну (в останній концентрація становить 10- 25 % від такої в плазмі), вибірково накопичується у кістках, печінці, селезінці, пухлинах, зубах. Проникає через плаценту та в грудне молоко. Метаболізму не піддається.

Виділяється з організму в основному з сечею i калом, частково з жовчю. При прийомі внутрішньо тетрациклін виділяється у значній кількості з калом (20 – 50 % від прийнятої дози). Виділення через нирки відбувається шляхом клубочкової фільтрації.

При порушенні видільної функції нирок виділення тетрацикліну з сечею зменшується i підвищується концентрація у кpoвi, що може призвести до явищ кумуляції.

Ванкоміцин (продуцент S. orientalis). Механізм дії полягає у пригніченні синтезу бактеріальної стінки за рахунок гальмування полімеризації глікопептидів таселективному інгібуванні синтезу РНК бактерій. Ванкоміцин ефективний відносно багатьох грампозитивних бактерій, у тому числі Staphylococcus aureus та Staphylococcus epidermidis (включаючи гетерогенні метицилінрезистентні штами);стрептококи, у тому числі Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae (включаючи пеніцилінрезистентні штами), Streptococcus agalactiae, групузеленящих стрептококів, Streptococcus bovis і ентерококи (наприклад, Enterococcus faecalis); Clostridium difficile (у тому числі токсикогенніштами-збудники псевдомембранозного ентероколіту), а також дифтероїди. Дованкоміцину in vitro чутливі Listeria monocitogenes, Lactobacillus species,Actinomyces species, Clostridium species, Bacillus species. Він не активний invitro відносно грамнегативних бактерій, грибів і мікобактерій. У ванкоміцинувідсутня перехресна резистентність до інших антибіотиків.

Ванкоміцин погано всмоктується в шлунково-кишковому тракті, у зв’язку з чим, як правило, вводиться парентерально. Безпосередньо після внутрішньовенного введення досягається максимальна концентрація препарату в плазмі крові, що підтримується на цьому рівні протягом майже 60 хв., після чого знижується плавно протягом 11-12 год. Багаторазові введення не впливають на концентрацію ванкоміцину в плазмі крові. Майже 55% введеного ванкоміцину зв’язується з білками плазми крові. Після внутрішньовенного введення інгібуюча для мікроорганізмів концентрація препарату виявляється в плевральній, перикардіальній, асцитичній та синовіальній рідинах, у сечі, рідині перитонеального діалізу, у тканині вушка передсердя. Незважаючи на погане проникнення через м’яку мозкову оболонку в нормі, ванкоміцин в умовах її запалення добре проникає в спинномозкову рідину. У незначних кількостях він виявляється в жовчі, виділяється в грудне молоко.

Період напівжиття препарату в плазмі у дорослих з нормальною функцією нирок становить в середньому 4-6 год; через 2-3 дні після внутрішньовенних введень з інтервалом 6-12 год спостерігається тенденція до його накопичення в організмі. Ванкоміцин виводиться з організму переважно нирками в практично незміненому стані. Протягом перших 24 год із сечею виділяється близько 75% від введеної парентерально дози. Незначною мірою препаратвиділяється з жовчю. Лише невелика кількість ванкоміцину виводиться при гемо- та перитонеальному діалізі. Загальний системний і нирковий кліренс препарату знижується у пацієнтів похилого віку.

Рифаміцин (продуцент S. mediterranei). Рифампіцин – напівсинтетичний антибіотик широкого спектра дії. Бактерицидна дія базується на селективному інгібуванні ДНК-залежної РНК-полімерази. У низьких концентраціях активний щодо мікобактерій туберкульозу та лепри, впливає на грампозитивні та грам негативні коки (стафіло-, стрепто-, пневмо-, ентеро-, менінго- і гонококи), у більш високих концентраціях активний стосовно грамнегативних бактерій (E. coli, K. pneumoniae, H. influenzae, Legionellae, Salmonellae, Shigellae, деяких штамів Proteus, P.aeruginosae), деяких спороутворюючих паличок (Bacillus anthracis, Clostridium perfringens) і хламідій. Рифампіцин віруліцидно діє на вірус сказуі пригнічує розвиток рабічного енцефаліту.

Рифампіцин добре всмоктується у шлунково-кишковому тракті і швидко проникає в тканини і рідини організму, у тому числі в каверни, кістки, плевральний ексудат, мокротиння. Біодоступність становить 90-95%.Максимальна концентрація препарату в крові відзначається через 2-2,5 години після прийому внутрішньо. На терапевтичному рівні концентрація підтримується протягом 8–12 годин (для високочутливих збудників – протягом 24 годин). Зв’язування з білками плазми крові становить 80—90%. Рифампіцин проникає через гематоенцефалічний бар”єр, плаценту, виявляється в грудному молоці. Біотрансформується в печінці. У зв’язку зішвидким розвитком стійкості до антибіотика в процесі лікування, застосування рифампіцину при захворюваннях не туберкульозної етіології обмежується випадками, які не піддаються терапії іншими антибіотиками.

Левоміцетин (продуцент S. venezuelae). Препарат виявляє антимікробну дію при місцевому застосуванні відносно більшості грам позитивних і грам негативних бактерій. Терапевтичні концентрації левоміцетину при застосуванні його місцево виявляються у склоподібному тілі, рогівці, райдужній оболонці, водявій волозі очей (у кришталик левоміцетин не проникає).Виводиться, головним чином, із сечею, в основному у вигляді неактивних метаболітів, частково - із жовчю і калом. У кишечнику під впливом кишкових бактерій левоміцетин гідролізується з утворенням неактивних метаболітів.

Препарат застосовують при лікуванні кон’юнктивітів, кератитів та інших інфекційних процесів, спричинених збудниками, чутливими до левоміцетину. Препарат показаний, коли неефективні інші хіміотерапевтичні засоби або їх застосування неможливо через непереносимість.

Лінкоміцин (продуцент S. lincolnensis). Антибіотик групи лінкозамідів. У терапевтичних дозах діє бактеріостатично, при більш високих дозах маєбактерицидну дію. Антибактеріальний механізм ґрунтується на принципі зворотнього зв’язування лінкоміцину з 50S субодиницею рибосоми бактерій, що призводить до порушення процесу синтезу білка і руйнування мікроорганізму.

Препарат активний відносно грам позитивних аеробів: Staphylococcus spp., включаючи штами, що продукують пеніциліназу; Streptococcus spp. (у т.ч. на Staphylococcus pneumoniae), Bacillus anthracis, Сorynebacterium diphtheriae; грам позитивних анаеробів: Actinomices spp., Bacteroides spp., Сlostridium spp., Peptococcus spp., Peptostreptococcus spp.; внутрішньоклітинних збудників Mycoplasma spp.

При пероральному прийомі лінкоміцину гідро хлорид швидко всмоктується з травного тракту, якщо приймається натще. Біодоступність становить 20 - 40 % від прийнятої дози. Препарат розподіляється по всьому організму, проникає у більшість рідин і тканин (печінка, нирки, міокард, легені, у тому числі у кісткову тканину, де накопичується у відносно високих концентраціях). Крізь гематоенцефалічний бар’єр проникає в незначній кількості, але проникність підвищується при менінгіті. Проникає також крізь плаценту тавиділяється з молоком матері. Частково метаболізується в печінці до неактивних метаболітів. Зв'язування з білками зменшується зі збільшенням концентрації препарату в плазмі крові і, в середньому, становить 70 - 76 %.

Період напіввиведення у хворих з нормальною функцією печінки та нирок 4- 6 годин, у хворих на термінальну ниркову недостатність 10 - 20 годин. Після одноразового прийому препарату внутрішньо максимальна концентрація в плазмі крові досягається через 2 - 4 години.

Виводиться в незмінному вигляді та у вигляді метаболітів з сечею, жовчю та калом (приблизно 30 - 40 % від прийнятої внутрішньо дози виводиться з калом за 72 години).

2.3. Протигрибні

Ністатин (продуцент S. noursei). Ністатин – антибіотик з полієновоїгрупи, що продукується актиноміцетом Streptomyces noursei.

Ністатин зв’язується зі стеринами клітинної мембрани грибків, внаслідок чого мембрана стає нездатною функціонувати як селективний бар’єр, що призводить до втрати основних компонентів клітини.

Ністатин різною мірою пошкоджує збудників дерматомікозів, глибоких та вісцеральних бластомікозів, збудників хромомікозу та споротрихозу, пліснявих мікозів, деяких патогенних найпростіших. Особливо чутливі до препарату дріжджоподібні грибки роду Candida та аспергили. Ністатин пригнічує розвиток вегетативних форм дезинтерійних амеб у кишечнику і застосовується для знищення грибків роду Candida у їх носіїв. Стійкість до ністатину у грибків роду Candida та інших чутливих видів розвивається повільно.

При прийомі внутрішньо погано всмоктується в травному тракті (його біодоступність не перевищує 3 – 5%). Фунгістатичні концентрації антибіотика в крові і близькі до терапевтичних в тканинах внутрішніх органівдосягаються тільки при введенні його у великих дозах. Препарат не проникаєкрізь гематоенцефалічний бар’єр і не надходить у спинномозкову рідину.

Основна маса прийнятого внутрішньо антибіотика виділяється з калом у незміненому вигляді, при цьому у випорожненнях створюються високі його концентрації, достатні для прояву лікувального ефекту при кандидомікозі слизової оболонки травного каналу.

Препарат, що всмоктався, виводиться з організму із сечею.

Амфотеріцин B (продуцент S. nodosus).  Полієновий макроциклічний антибіотик з протигрибковою активністю. Продукується Streptomyces nodosus. Надає дію фунгіциду або фунгістатично залежно від концентрації в біологічних рідинах і від чутливості збудника. Зв'язується із стеролами (ергостеролами), що знаходяться в клітинній мембрані гриба. В результаті порушується проникність мембрани і відбувається вихід внутріклітинних компонентів в позаклітинний простір і лізис гриба. Активний відносно Candida spp., Cryptococcus neoformans, Aspergillus spp. і інших грибів. Не діє на бактерії, рикетсії, віруси.

Натаміцин (продуцент S. natalensis). Комбінований препарат, який за допомогою компонентів, що входять до його складу, справляє протимікробну, протигрибкову, місцеву протизапальну дію. Гідрокортизон має протизапальний і протисвербіжний вплив. Зменшує запальні явища, свербіж, які супроводжують різні види дерматозів. Неоміцин є антибіотиком широкого спектра дії, активний щодо низки грам позитивних (стафілококів, ентерококів) і грам негативних (Klebsiella spp., Proteus spp., Escherichia coli) бактерій. Натаміцин належить до полієнових антибіотиків групи макролідів, активний відносно дріжджових і дріжджоподібних грибів (у т.ч. Candida, Aspergillus), дерматофітів (серед них - Trichophyton, Microsporum), а також Trichomonas, Torulopsis, Fusarium.

Натаміцин і неоміцин практично не абсорбуються через ушкоджену шкіру та слизові оболонки. Можлива абсорбція неоміцину через ушкоджену шкіру, при потраплянні препарату на рани, виразки. Через неушкоджену шкіру абсорбується від 1 до 3% гідрокортизону; при екземі кількість гідрокортизону, що абсорбується, збільшується у 2 рази, при інфекційних ураженнях шкіри – у 5 разів. У дітей абсорбція гідрокортизону крізь неушкодженну шкіру вище, ніж у дорослих.

3. Механізми синтезу антибіотиків

Перше завдання при пошуку продуцентів антибіотиків - виділення їх з природних джерел. Разом з тим для цих цілей широко застосовується метод зміни геному виділеного продуцента антибіотика шляхом мутагенезу та генної інженерії [1, c. 126].

В основу більшості прийомів виділення продуцентів покладено принцип виділення чистої культури мікроба і безпосереднього випробування його по відношенню до використовуваних тест-організмів. Більшість сапрофітних бактерій добре розвивається на багатих за складом натуральних середовищах (м’ясопептонний агар, картопляний агар, сусло-агар та ін.) при рН близько 7,0 і температурі 30-37°C.

У цих же умовах розвиваються актиноміцети і деякі гриби, але для них вони менш сприятливі, ніж для бактерій. Актиноміцети ростуть повільніше, ніж бактерії, вони можуть використовувати такі джерела живлення, які не дуже добре засвоюються бактеріями. Значення рН середовища після стерилізації встановлюється в межах 6,8-7,1.

Міцеліальні гриби краще розвиваються на середовищах з дещо зниженим значенням рН (4,5-5,0), на яких погано ростуть багато бактерії і актиноміцети.

Технологічний процес виробництва антибіотиків починається зі стадії біосинтезу антибіотичниx речовин в умовах глибинного культивування продуцента - мікроорганізму (ферментера) в спеціально підібраною поживному середовищі при строго контрольованiй температурі та інтенсивнiй аерації зі збереженням повної стерильності під час всього процесу ферментації [5, c. 203]. Якість антибіотиків, що отримуються в результаті промислового виробництва, значною мірою залежить від рівня біосинтетичнoї активності штаму-продуцента. У промисловості використовують тільки високопродуктивні штами мікроорганізмів, вирощені в процесі тривалої селекційної роботи.

Тривалість вирощування штаму-продуцента коливається від 48 годин до кількох діб. Після завершення процесу культивування продуцента культуральну рідину піддають спеціальній обробці і наступнiй фільтрації (відокремлення від біомаси продуцента). Потім в залежності від властивостей антибіотика і його хімічної будови застосовують різні методи виділення і очищення. В якості основних методів використовують екстракцію, осадження, сорбцію на іонообмінних матеріалах, упарювання і сушку [5, c. 243].

Ферментаційні процеси одержання антибіотиків ще не досягли тої досконалості, що могла б бути забезпечена завдяки комп'ютерній техніці й розумінню фізіології продуцентів. Своєрідним гальмом удосконалювання технології виступають самі клітинні популяції мікроорганізмів, які змінюються якісно й кількісно протягом усього продуктивного циклу. Тому не вдається одержувати повністю ідентичних результатів навіть у двох суміжних ферментаціях, так само як і всьому технологічному процесі вдається порівняно добре проводити лише в періодичному режимі.

Тому що антибіотичні речовини є вторинними метоболітами, то біосинтез їх сполучений з переходом культури продуцента в ідіофазу. Отже, тут доцільне лімітування росту продуцента. Таким фактором, що лімітує, при біосинтезі пеніциліну виступає глюкоза, тоді як при біосинтезі антибіотиків стрептоміцетами - фосфати. Все це важливо при компановці  живильних  середовищ, підгодівлі штаму - продуцента в процесі біосинтезу антибіотика. Так, середовище для продукції пеніциліну (вона ж придатна для нагромадження інокулюму) включає глюкозу - 1,5%, лактозу - 5% (лактоза знімає катаболітну  репресію глюкози), амонію сульфат і фосфати - 0, 5-1%, кукурудзяний екстракт - 2-3%, попередники антибіотика - фенокси- або фенілоцтова  кислота - 0, 3-0,6%, крейда - 0, 5-1%, піногасник - 0, 5-1%; температуру ферментації підтримують на рівні 22-26 С при рн від 5,0 до 7,5 і аерації 1 м3 повітря на 1 м3 середовища в 1 хвилину; тривалість ферментації - 4 доби [18].

Так звана "всеїдність" актиноміцетів забезпечує ним здатність рости й продуціювати антибіотики на середовищах, що містять білки (соєве борошно, рибне борошно, білок клейковини пшениці та ін.), крохмаль. Проте, стосовно до кожного продуцента є свої особливості, звичайно відмічувані в регламентній документації. Наприклад, посівний матеріал Streptomyces kanamyceticus одержують на соєво-крохмальному середовищі й на ній же проводять основну ферментацію при 27-28 С протягом 4-5 доби при підтримці рн на рівні 7, 1-7,6.

При ферментації Str. floridae (продуцент віоміцину, або флориміцину) рекомендують середовище, що містить глюкозу або гідрол, соєве борошно, кукурудзяний екстракт, нітрати, крейду; температуру підтримують у межах 27-29 С, рн на рівні 7, 0-7,3.

У випадку ферментації Str. erythreus у живильне додавати середовище пропиловий спирт, як попередник антибіотика еритроміцину.

Продуцент ністатину  Str. noursei інтенсивно споживає амонійний азот (не нітратний), і т.д.

Перед виділенням антибіотика з культуральної рідини необхідно відокремити тверду, або щільну фазу від рідкої. У цих випадках, як правило, використовують фільтрацію. Якість твердої фази помітно позначається на ефективності фільтрації. Тут можна відзначити наступну закономірність – натівна  бактеріальна маса фільтрується гірше міцеліальної [19]. З урахуванням того факту, що вищі актиноміцети здатні формувати ниткові  структури, то їхнє відділення при фільтрації відбувається трохи легше, ніж інших бактерій.

Шляхи поліпшення фільтрації: обробка ростових середовищ електролітами, теплова коагуляція, додавання фільтруючих наповнювачів, кислотна коагуляція й деякі інші.

Труднощі виділення антибіотиків обумовлені багатокомпонентністю  культуральних рідин і малою концентрацією в них цільових продуктів. Так, пеніцилін може накопичуватися приблизно до 30 г/л при 8%-м виході від субстрату. При цьому сухі речовини після відділення міцелію звичайно становлять порядку 3-6%, з яких лише 15-30% доводяться на антибіотик. Тому будь-яке культуральне середовище необхідно обробляти так, щоб антибіотична речовина переходила в ту фазу, з якої потім він буде найбільше повно виділений. У ряді випадків цього можна домогтися підкисленням (тетрацикліни) або, навпроти, підлугуванням  культуральної рідини (новобіоцин), додаванням солей, щавлевої кислоти (еритроміцин) і т.д., до або після коагуляції й осадження білків з натівних розчинів.

Якщо для виділення антибіотика застосовують іонний обмін, то натівний розчин прагнуть звільнити від іонів-конкурентів (розчинні оксалати - для видалення іонів кальцію; натрію триполіфосфат - для зв'язування іонів магнію; жовта кров'яна сіль - для комплексовання іонів заліза).

Антибіотичні речовини, що накопичуються в клітинній біомасі в процесі ферментації мікробів-продуцентів, виділяють іншими методами, ніж антибіотики, що втримуються в культуральній  рідині. У першому випадку, як правило, необхідна екстракція яким-небудь розчинником з натівних або дезінтегрованих клітин (система "тверде тіло-рідина").

До числа найбільш істотних факторів, які впливають на прояв антибіотичних властивостей мікроорганізмів, відносяться склад середовища, її активна кислотність, окислювально-відновлювальні умови, температура культивування, методи спільного вирощування двох або більшої кількості мікроорганізмів і інші фактори.

Середовища та умови для культивування мікроорганізмів

Натуральні (комплексні) середовища, що складаються з природних сполук і мають невизначений хімічний склад (частини зелених рослин, тваринні тканини, солод, дріжджі, фрукти, овочі, гній, грунт і т. д.), містять всі компоненти, необхідні для росту і розвитку мікроорганізмів більшості видів [3, c. 97]. Використовуються такі середовища:

• м’ясопептонна середa, до складу якої з м'ясним екстрактом і пептонiв входять хлорид натрію, фосфат калію, іноді глюкоза або сахароза;

• картопляні середовища з глюкозою і пептони, що використовуються в лабораторії для культивування багатьох видів актиноміцетів і бактерій;

• середовища з кукурудзяним екстрактом, соєвим борошном та іншими речовинами, до складу яких входять сульфат амонію, карбонат кальцію, фосфати, глюкоза, сахароза, лактоза або інші вуглеводи і ряд інших сполук; середовища успішно застосовуються в промисловості, тому що є дешевими і забезпечують розвиток мікроорганізмів з високим виходом антибіотиків.

Оскільки натуральні середовища не дозволяють отримувати суворі кількісні дані для вивчення фізіологічних і біохімічних особливостей організму, застосовують синтетичні середовища, які підбирають для окремих продуцентів індивідуально. Синтетичні середовища можуть бути,як відносно простими, так і складними, для складання яких використовують методи математичного планування експерименту [1, c. 157]. Джерелами вуглецю можуть бути органічні кислоти, спирти, вуглеводи, поєднання різних сполук.

При промисловому отриманні ряду антибіотиків, як джерела вуглецю нерідко застосовують картопляний крохмаль, кукурудзяне борошно або інші рослинні матеріали [1, c. 92]. Однак не всі продуценти мають досить активнi амілази, якi здатнi здійснювати гідроліз крoхмаловмiстивої сировини. Попереднє оцукрювання крoхмаловмiстивиx матеріалів за допомогою ферментів значно полегшує використання мікроорганізмами цих матеріалів. Джерела азоту дуже впливають на формування мікроорганізмами антибіотичних речовин. Зазвичай в середовищах для культивування мікроорганізмів джерелом азоту служать солі азотної (рідше азотистої) кислоти, амонійні солі органічних та неорганічних кислот, амінокислоти, білки і продукти їх гідролізу.

Багато мікроорганізмів успішно використовують і окислені форми азоту, деякі з них потребують саме нітратного джерелa азоту (Streptomyces auranticus, S. subtropicus і деякі інші) [20]. Ряд актиноміцетів іноді засвоюють краще нітрати, ніж амонійні солі; вони можуть використовувати навіть нітрити, якщо їх вносять у середу в невеликих кількостях (не більше 50 мг NaNO2/1л середовища). При цьому засвоєння нітритів тісно пов'язане з джерелом вуглецю; наприклад у присутності гліцерину нітрити споживаються набагато краще, ніж в присутності глюкози. Використання амонію та деяких органічних джерел азоту цвілевими грибами поліпшується у присутності невеликих кількостей (0,1-0,2%) деяких дикарбонових (янтарної і фумарової) кислот. У ряді випадків для накопичення антибіотика необхідна присутність і амонійного, нітратного і джерела азоту (біосинтез пеніциліну). Зазвичай найбільш сприятливим для мікроорганізмів є співвідношення C:N=20. Однак для формування антибіотика таке співвідношення не завжди оптимально. Тому для кожного продуцента необхідно підбирати відповідне співвідношення вуглецю та азоту [21]. Джерелами мінерального живлення служать фосфор, сірка та інші макро-та мікроелементи. Більшість мікроорганізмів легко використовують, як джерела фосфору ортофосфати. Окремі види поряд з цим споживають і фітати (солі інозітфосфорних кислот). Продуценти антибіотиків по відношенню до концентрації фосфору в середовищі можна розділити на три групи [22]:

• високочутливі продуценти, для яких оптимальна концентрація фосфору в середовищі становить менше 0,01% (продуценти нистатина, тетрацикліну, флоріміціна, ванкоміцину);

• продуценти середньої чутливості, для яких оптимальна концентрація фосфору становить 0,010-0,015% (продуценти стрептоміцину, еритроміцину, циклосерином, неоміцину);

• малочутливі продуценти, для яких оптимальна концентрація фосфору становить 0,018-0,020% (продуценти новобіоціна, граміцидину, олеандоміцин) [6, c. 104].

Сірка входить до складу деяких антибіотиків, утворених грибами (пеніцилін, цефалоспорин, гліотоксін тощо), бактеріями (бацитрацин, субтіліни, низини) і актиноміцетів (ехіноміціни, група тіострептона). Зазвичай джерелом сірки в середовищі служать сульфати. Однак при біосинтезі пеніциліну кращим джерелом сірки для продуцента служить тіосульфат натрію.

Багато бактеріальниx організмiв, які синтезують антибіотики, краще розвиваються при рН близько 7,0, хоча деякі, наприклад молочнокислі стрептококи, що продукують низин, краще розвиваються в середовищі при рН=5,5÷6,0. Більшість актиноміцетів добре розвиваються при початкових значеннях рН середовища в межах від 6,7 до 7,8; в більшості випадків життєздатність актиноміцетів при рН нижче 4,0-4,5 пригнічена [6, c. 288].

Для більшості бактеріальних організмів температурний оптимум розвитку лежить в діапазоні 30-37°С. Для продуцента граміцидину С (B. brevis) оптимальна температура для розвитку та біосинтезу дорівнює 40°С. Актиноміцети, як правило, культивуються при температурі 26-30°С, хоча деякі види стрептоміцетів можуть розвиватися і  при знижених (від 0 до 18).

 


Висновок

Стрептоміцети—найвисокорозвиненіші прокаріотичні мікроорганізми з міцеліальною будовою клітин і спороутворенням , що становлять значний науковий інтерес для генетики і мають не менше практичне значення для біотехнології як промислові продуценти більшості описаних антибіотиків.

Основу більшості прийомів виділення продуцентів покладено принцип виділення чистої культури мікроба і випробування його по відношенню до використовуваних тест-організмів.

Технологічний процес виробництва антибіотиків починається зі стадії біосинтезу антибіотичних речовин в умовах глибинного культивування продуцента - мікроорганізму (ферментера) в спеціально підібраною поживному середовищі при строго контрольованій температурі та інтенсивній аерації зі збереженням повної стерильності під час всього процесу ферментації.

Продуценти антибіотиків розподіляються на групи:

• високочутливі продуценти, для яких оптимальна концентрація фосфору в середовищі становить менше 0,01%;

• продуценти середньої чутливості, для яких оптимальна концентрація фосфору становить 0,010-0,015%;

• малочутливі продуценти, для яких оптимальна концентрація фосфору становить 0,018-0,020%.

 

 


Список літератури

Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии. – Москва, «Химия» - «Колос», 2004 г. – 296 с.

Варт А.В. Інфекції й імунодефіцити – пріоритети сьогодні // Практикуючий лікар. - 1997. - № 9. - С. 3-4.

Егоров Н. С. Основы учения об антибиотиках: Учебник. - 6-е изд., 2004. – 528 c.

Костінов М.П. Нове в клініці, діагностиці і вакцинопрофилактиці керованих інфекцій. - М., 1997. - 110 с.

Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. - М.: Медицина, 1978. – 394 с

Паренти Ф., Ланчини Д. Антибиотики. - Издательство: Мир, 1985. - 272 с.

Madigan M; Martinko J (editors). Brock Biology of Microorganisms, вид. 11th ed., 2005, Prentice Hall. ISBN 0-13-144329-1.

Bentley SD, et al. (2002). Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature 417: 141–147.

Ikeda H; Ishikawa J; Hanamoto A; Shinose M; Kikuchi H; Shiba T; Sakaki Y; Hattori M; Omura S (2003). Complete genome sequence and comparative analysis of the industrial microorganism Streptomyces avermitilis. Nat. Biotechnol. 21: 526–531.

Обращение лекарственных средств. ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Росздравнадзора РФ (27.03.2008). — Типовая клинико-фармакологическая статья является подзаконным актом и не охраняется авторским правом согласно части четвёртой Гражданского кодекса Российской Федерации №230-ФЗ от 18 декабря 2006 года. Проверено 20 мая 2008.

Даунорубицина гидрохлорид /Daunorubicin hydrochloride // European Pharmacopoeia. Fifth Edition : монография. — 2005. — С. 1389—1390.

«Биологический энциклопедический словарь.» Гл. ред. М. С. Гиляров; Редкол.: А. А. Бабаев, Г. Г. Винберг, Г. А. Заварзин и др. — 2-е изд., исправл. — М.: Сов. Энциклопедия, 1986.)

Определение нуклеотидной последовательности и характеристика нового аминоглико-зидфосфотрансферазного гена aph Vlll из штамма Streptomyces rimosus / В. Н. Даниленко, К. Э. Акопянц, И. А. Сизова, Т. А. Мичур С. 1478–148

Табаков В. Т. А. Воейкова // Генетика. – 1997. – Т. 33, № 11. – С. 1461–1477.

Stone M. On the evolution of functiona D. Williams // Mol. Microbiology. – 1992. – Vol. 6. – Р. 29–34.

Hopwood D. A. Streptomyces // Genetics and breeding of ind D. A. Hopwood, K. F. Chater. – Rosa Raton: CRC, Inc, Fla, 1984. – P. 7–42.

Lancini G. Biotechnology of antibiotics and other bioactive microbial metabolites / G. Lancini, R. Lozensetti. – L.: Plen. Press, 1993. – 236 p.

Why oure secondary metabolites biosintesised / D. H. Williams, M. J. Stone, P. R. Hauck, S. K. Rahman // J. Natl. Prod. – 1989. – Vol. 52. – P. 1189–1208.

Никитин Г.А. Биохимические основы микробиологических производств. Киев, Вища школа, 1992

Варфоломеев С.Д., Калюжный С.В. Биотехнология. Кинетические основы микробиологических процесов. М.Высшая школа, 1990.

Векірчик К.М. Мікробіологія з основами вірусології: Підручник. – К.: Либідь, 2001. – 312 с.

Федоренко В. О., Осташ Б. О., Гончар М. В., Ребець Ю. В. Великий практикум з генетики, генетичної інженерії та аналітичної біотехнології мікроорганізмів. Львів: Видавн. центр ЛНУ імені Івана Франка, 2007. 277 с.

 



Другие работы по теме: